【摘要】：蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的寄生于對蝦肝胰腺組織的新病原,2009年泰國養(yǎng)殖的生長緩慢的斑節(jié)對蝦首次發(fā)現(xiàn)并命名。盡管蝦肝腸胞蟲不會引起對蝦的死亡,但它與對蝦生長緩慢有關(guān)。早期死亡綜合征或者急性肝胰腺壞死病(AHPND/EMS)引起的蝦高致死率使得人們將更多的注意力集中到AHPND/EMS上面,忽視了蝦肝腸胞蟲造成的影響,這使得蝦肝腸胞蟲的傳播越來越廣泛,有信息表明在中國、印度尼西亞、馬來西亞、越南、印度和泰國中都有檢出。本文從實時熒光定量檢測方法的建立、人工感染實驗、肝腸胞蟲的寄生數(shù)量與對蝦生長相關(guān)性幾個方面進(jìn)行研究。根據(jù)Genbank中公布的對蝦肝腸胞蟲SSU r DNA序列設(shè)計一對特異性引物,通過對引物的特異性以及靈敏度檢測實驗表明引物具有良好的特有性和較高的靈敏度。利用p MD18-T構(gòu)建含有SSU r DNA序列的重組質(zhì)粒作為實驗標(biāo)準(zhǔn)品,對反應(yīng)體系進(jìn)行多次優(yōu)化建立了肝腸胞蟲SYBR Green實時熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示,構(gòu)建的方法擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與目的基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系,且Tm值為60℃時擴(kuò)增效果最好,熔解曲線僅有一個單一的特異峰,擴(kuò)增所的擴(kuò)增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與模板起始量的對數(shù)標(biāo)的準(zhǔn)曲線為Ct=-3.369log(Sq)+39.364,相關(guān)系數(shù)R2=0.992,擴(kuò)增效率為98.5%。利用建立的熒光定量方法檢測了海南采集的31份個體生長大小不均勻的凡納濱對蝦樣品,肝腸胞蟲的陽性檢出率為67.7%,高于常規(guī)PCR檢測,而且通過溶解曲線分析特異性良好,表明該方法具備較好的適用性。建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法具有特異、靈敏、快速、定量的優(yōu)點,可為肝腸胞蟲進(jìn)行快速檢測以及定量研究提供參考。人工感染實驗利用凡納濱對蝦幼蝦和鹵蟲進(jìn)行,用冰凍和鮮活的的感染有肝腸胞蟲的凡納濱對蝦肝胰腺組織去投喂健康的凡納濱對蝦,投喂一周后的樣品套式PCR檢測結(jié)果顯示投喂冰凍和鮮活肝胰腺組織病料都可以使健康幼蝦感染肝腸胞蟲。說明肝腸胞蟲的孢子能夠抵抗較差的外界環(huán)境,低溫冰凍后仍然具有感染力,這也為生產(chǎn)上肝腸胞蟲的預(yù)防和治療帶來了麻煩。鹵蟲感染實驗樣品套式PCR檢測結(jié)果顯示為陰性,利用實驗建立的實時熒光定量PCR方法檢測結(jié)果顯示為陽性。說明肝腸胞蟲感染鹵蟲后并沒有在鹵蟲體內(nèi)大量繁殖,但是肝腸胞蟲可以在鹵蟲體內(nèi)寄生存活。在對蝦肝腸胞蟲的流行病學(xué)調(diào)查過程中,我們采集了山東即墨、江蘇贛榆以及海南儋州三個地區(qū)生長緩慢且個體大小差異明顯的凡納濱對蝦樣品,并測量了這幾批凡納濱對蝦的體長,懷疑這幾批樣品是因為感染對蝦肝腸胞蟲而導(dǎo)致其生長緩慢,并且出現(xiàn)個體大小差異的明顯癥狀,利用實時熒光定量PCR檢測方法分析了肝腸胞蟲對這幾批凡納濱對蝦樣品生長的影響。實驗同時對WSSV、IHHNV、CMNV、AHPND四種病原進(jìn)行PCR檢測,檢測結(jié)果顯示這幾種病原的檢出率很低。Real-time PCR檢測肝腸胞蟲結(jié)果顯示海南儋州肝腸胞蟲檢出率為68%,江蘇贛榆和山東即墨樣品肝腸胞蟲全部為陽性。利用本方法對采集自江蘇、海南和山東的三批凡納濱對蝦共94份的肝胰腺組織DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA進(jìn)行了實時熒光定量PCR檢測,結(jié)果表明EHP的載量指數(shù)與對蝦生長速率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,肝胰腺中EHP載量在103 copies/(ng Hp DNA)時代表了較高的風(fēng)險水平。本實驗建立的實時熒光定量PCR方法具有特異、靈敏、快速、定量的優(yōu)點,所建立的方法及檢測數(shù)據(jù)可為EHP的防控提供技術(shù)和參考。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S945.4
【圖文】：

除了EHP的常規(guī)PCR為陽性的樣品有擴(kuò)增曲線外，其余樣品以及陰性對照均沒有檢測到熒光信號。將實時熒光定量PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2-2），結(jié)果顯示，只有EHP陽性樣品泳道有與目的產(chǎn)物分子量大小一致的產(chǎn)物條帶，其余泳道均為陰性，進(jìn)一步說明所設(shè)計的引物的特異性。圖2-1 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實時熒光定量PCR引物ENF185和ENR185的擴(kuò)增曲線Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei圖2-2 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實時熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳M. DL2000；1. EHP的PCR檢測為陽性的凡納濱對蝦樣品總DNA；2. WSSV純病毒基因組EHPOtherpathogens

對蝦總DNA、HPV陽性的中國明對蝦總DNA、純化WSSV的核酸、感染副溶血弧菌的凡納濱對蝦總DNA、健康凡納濱對蝦總DNA以及水為模板的空白對照，用引物ENF185和ENR185進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增曲線（圖2-1）顯示，除了EHP的常規(guī)PCR為陽性的樣品有擴(kuò)增曲線外，其余樣品以及陰性對照均沒有檢測到熒光信號。將實時熒光定量PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2-2），結(jié)果顯示，只有EHP陽性樣品泳道有與目的產(chǎn)物分子量大小一致的產(chǎn)物條帶，其余泳道均為陰性，進(jìn)一步說明所設(shè)計的引物的特異性。圖2-1 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實時熒光定量PCR引物ENF185和ENR185的擴(kuò)增曲線Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei圖2-2 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實時熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳M. DL2000；1. EHP的PCR檢測為陽性的凡納濱對蝦樣品總DNA；2. WSSV純病毒基因組EHPOtherpathogens

8.3 × 101copies/μL之間均有較強的熒光信號（圖2-3），而且擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S曲線，在模板濃度為8.3 ×100copies/μL時經(jīng)40個循環(huán)擴(kuò)增，未檢測到擴(kuò)增的熒光信號，說明本實驗建立的實時熒光定量PCR至少可以檢測到8.3 ×101copies的模板，具有較高的靈敏度。常規(guī)PCR采用8.3 ×1058.3 ×101copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)為模板，經(jīng)35循環(huán)擴(kuò)增后產(chǎn)物凝膠電泳分析，結(jié)果顯示該對引物通過常規(guī)PCR能檢測到的最低為8.3 ×102copies/μL的模板，但是在該濃度下電泳條帶亮度特別弱，幾乎看不到（圖2-4）。說明實時熒光定量PCR至少比常規(guī)PCR定性檢測的靈敏度高1個數(shù)量級。圖2-3 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的實時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.2- 3 Amplification curve of qPCR for E. hepatopenaei SSU rDNA with plasmid strandardtemplates8.3×1088.3×1078.3×1068.3×1058.3×1048.3×1038.3×1028.3×1018.3×100

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2781075