【摘要】：在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,魚類經(jīng)常會受到各種來自外界的不良應激,導致魚體生長受阻,嚴重時會導致魚病爆發(fā),甚至死亡,影響了水產(chǎn)食品安全以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此,提高魚體免疫力、減少病害已是大家關(guān)注的熱點。大黃素是中草藥大黃的主要提取成分之一,具有抗菌、抗病毒、抗應激、增強免疫力、誘食、營養(yǎng)以及改善水質(zhì)等多重功效。作為免疫增強劑,中草藥沒有抗生素和化學藥品存在的耐藥性等弊端,既能防治水產(chǎn)動物病害,又能夠作為營養(yǎng)素促進消化吸收和生長,成為抗生素、激素和其他化學藥品替代研究的熱點,已被廣泛應用于人類疾病防控以及養(yǎng)殖業(yè)。團頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種,鑒于養(yǎng)殖過程中的疾病易爆發(fā)等問題,本研究旨在通過蛋白質(zhì)組學的研究方法確定飼料中添加大黃素對團頭魴肝臟差異蛋白質(zhì)組的影響,了解代謝、抗氧化及免疫相關(guān)差異表達蛋白的相互作用機制,為大黃素在團頭魴養(yǎng)殖中的應用提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:1日糧添加大黃素的團頭魴肝臟差異蛋白質(zhì)組分析本實驗旨在利用基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學方法分離并鑒定飼料中添加30 mg/kg大黃素后團頭魴肝臟的差異表達蛋白。結(jié)果顯示,以表達豐度差異2倍以上為基準,共分離得到團頭魴肝臟差異表達蛋白質(zhì)點39個,成功鑒定38個,其中表達上調(diào)蛋白質(zhì)點8個,表達下調(diào)蛋白質(zhì)點30個,共包括25種不同蛋白質(zhì)。依據(jù)GO數(shù)據(jù)庫的生物功能注釋,以蛋白質(zhì)參與的生物學過程和分子功能為依據(jù),分離的差異蛋白質(zhì)點可以分為十類,包括糖代謝蛋白12個(8種,占31%),能量代謝蛋白8個(3種,占20%),免疫相關(guān)蛋白1個(1種,占2%),細胞骨架蛋白4個(2種,占10%),伴侶蛋白2個(2種,占5%),信號轉(zhuǎn)導蛋白1個(1種,占3%),抗氧化蛋白5個(2種,占13%),輔酶因子和維生素蛋白1個(1種,占3%),氨基酸代謝蛋白3個(3種,占5%),核苷酸代謝蛋白2個(2種,占8%)。2差異表達蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析及基因功能注釋本實驗旨在利用NCBI、STRING、DAVID、GO等數(shù)據(jù)庫的相關(guān)數(shù)據(jù),通過Cytoscape軟件構(gòu)建團頭魴肝臟差異表達蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)模型,并對差異表達蛋白基因進行功能注釋。結(jié)果顯示,在25種差異表達的蛋白中,有18種在機體的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用,分別為ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST、HSP70、Bhmt1、EEF2b、FTCD、Aldh8a1、Aldh9a1a、LDHBB、Eno3、Pgk1、ME1、ETFA 和AST。其中ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST和HSP70在大黃素對團頭魴的抗氧化應答過程中扮演重要角色,且除ALDOB和TP53外均表達上調(diào)。差異表達蛋白基因的GO功能注釋結(jié)果表明,差異表達蛋白基因主要參與機體代謝過程中的氧化還原反應,同時還參與了糖酵解、葡萄糖分解、單糖分解、己糖分解、乙醇分解、細胞碳水化合物分解等過程。在已經(jīng)檢索到的信息中,TP53、Aldh9a1a、ME1、Aldh8a1、LDHBB、Sord、ALDOB、HSP70和GPx1均參與了氧化代謝過程,與Cytoscape軟件的分析結(jié)果相吻合,說明 ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST 和 HSP70 蛋白在團頭魴抗氧化代謝中起重要作用。3差異表達蛋白的轉(zhuǎn)錄水平表達量驗證及功能分析本實驗旨在利用RT-PCR技術(shù)對差異表達蛋白進行轉(zhuǎn)錄水平的表達量驗證,并初步探討代謝、抗氧化及免疫相關(guān)蛋白的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果表明,30mg/kg大黃素添加組抗氧化相關(guān)蛋白ApoA1、ALDOB、GAPDH、HSP70、GPx1和GST的mRNA表達量均顯著高于對照組(P0.05)。隨著大黃素添加水平的提高,ApoA1、GAPDH、HSP70、GPx1和GST的mRNA相對表達量均呈先升高后降低的趨勢,且均在添加量為3Omg/kg時相對表達量最高;30mg/kg大黃素添加組糖代謝蛋白Aldh8a1、Eno3、Pgk1,能量代謝蛋白ETFA，氨基酸代謝蛋白FTCD的mRNA表達量均顯著高于對照組(P0.05),而糖代謝蛋白Sord,氨基酸代謝蛋白FAH,核苷酸代謝蛋白EEF2b的表達量顯著低于對照組(P0.05)。綜合以上所有結(jié)果可以表明,飼料中添加30 mg/kg大黃素能夠通過復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提高團頭魴的代謝、免疫及抗氧化性能。
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S965.119
【圖文】：

我們采用Ｖｏｌ邋％邋（占總蛋白含量的百分比）的概念計算每個樣品表達量的變化逡逑倍數(shù)。為避免系統(tǒng)誤差，每個樣品至少重復Ｈ次。表達豐度在２倍Ｗ上的視為差異蛋逡逑白，對照組和３０ｍｇ／ｋｇ大黃素添加組團頭妨肝臟的表達圖譜如圖２－１所示，表達有差逡逑異的蛋白質(zhì)點用綠色標出，并用數(shù)字標記對應的鞭向位置。逡逑邐ＩＥＦ邋ｐＨ邋４－７邐＾逡逑巧逡逑塞邋ｒ－＃邋．邋＇邋．邋？？玄來；＊壚題古作逡逑Ｓ邋，邐？，’邐？＂粒？巧己？逡逑，？邋一邋。，｜＾邋？逡逑？！邐？‘邐－’Ｉ邐！邋？邋？逡逑Ｉ邐‘試；、峽逡逑圖２－１邋３０邋ｍｇ／ｋｇ大黃素組團頭橆肝脂蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜（ｐＨ邋４－７）逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋２－ＤＥ邋ｍａｐ邋ｉｎ邋ｈｅｐａｒ邋ｏｆ邋Ｍ邋幻啤片ａ／幻邋ｆｆｅｄ邋ｄｉｅｔｓ邋ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋３０邋ｍｇ／ｋｇ邋ｅｍｏｄｉｎ邋（ｐＨ邋４－７）逡逑１９逡逑

將上述獲得的全部數(shù)據(jù)進行整理，刪除蛋白質(zhì)互作對中冗余數(shù)據(jù)和自作用數(shù)據(jù)，逡逑將整理后的數(shù)據(jù)導入Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ軟件（Ｖｅｒｓｉｏｎ邋３N１），依據(jù)檢索數(shù)據(jù)和差異蛋白的相逡逑對表達量調(diào)整相應節(jié)點、連線等，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，操作界面如圖３－１所示。逡逑建立的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系圖由節(jié)點（Ｎｏｄｅ）和連線（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）構(gòu)成，互作網(wǎng)絡(luò)逡逑中的節(jié)點代表相互作用的蛋白質(zhì)，連線代表蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，節(jié)點間連線逡逑的粗細代表互作強度的高低。逡逑Ｗ＃邋＇４卻邋９巧》知＞巧邐－－裕？逡逑一邐

本文編號：2781067