【摘要】：鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的條件致病菌之一,廣泛存在于海洋環(huán)境中,可感染魚、蝦、貝等多種水產(chǎn)動(dòng)物,引起的出血性敗血癥對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。VI型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system,T6SS)廣泛分布于革蘭氏陰性細(xì)菌中,具有提高病原菌的毒力、種間或種內(nèi)競爭、與宿主互惠共生、應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化等功能。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)鰻弧菌M3株的T6SS不表達(dá),即使改變多種培養(yǎng)條件和環(huán)境因子也未能激活T6SS。為了尋找影響鰻弧菌T6SS表達(dá)的因子,本文分析了幾種抗生素對(duì)M3 T6SS表達(dá)的影響,并構(gòu)建M3突變體庫來篩選影響T6SS表達(dá)的因子。但是這兩種方法均未能成功篩選到激活M3 T6SS的因子。于是基于該突變文庫,開展了影響鰻弧菌幾種毒力表型的基因的篩選。具體研究內(nèi)容如下:1.抗生素對(duì)鰻弧菌M3和MHK3T6SS表達(dá)的影響。鰻弧菌MHK3的T6SS處于激活狀態(tài),特征為能夠表達(dá)和分泌溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp),用作陽性對(duì)照菌株。本研究構(gòu)建了鰻弧菌融合菌株M3 lacZ::T6SS和MHK3 lacZ::T6SS,在抗生素脅迫下檢測(cè)鰻弧菌T6SS的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,在不同濃度的四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素、多粘菌素的作用下,鰻弧菌MHK3的生長在對(duì)數(shù)生長期受到抑制(p0.05),但在平臺(tái)生長期恢復(fù)了正常生長(p0.05);與此同時(shí),在整個(gè)生長期間,鰻弧菌T6SS的表達(dá)均受到顯著性抑制(p0.05)。鰻弧菌M3在抗生素的脅迫下T6SS依舊未檢測(cè)到表達(dá)。這些結(jié)果表明四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素、多粘菌素等抗生素的作用可以降低鰻弧菌MHK3 T6SS的表達(dá),但不能誘導(dǎo)M3 T6SS的表達(dá)。2.鰻弧菌M3轉(zhuǎn)座子突變體文庫的構(gòu)建和Hcp表達(dá)菌株的篩選。使用轉(zhuǎn)座子mini-Tn10(pLOF/Kana),利用電激轉(zhuǎn)化和細(xì)菌結(jié)合的方法,構(gòu)建了鰻弧菌M3菌株轉(zhuǎn)座子突變體文庫,共得到突變株1152株。利用RT-PCR和Westernblot的方法檢測(cè)突變文庫菌株hcp基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示,篩選到1株突變株2B_5的hcp基因轉(zhuǎn)錄水平比野生型M3菌株提高40倍,但未能檢測(cè)到該突變株表達(dá)Hcp蛋白。3.鰻弧菌M3毒力相關(guān)表型發(fā)生變化的突變株及基因的篩選。對(duì)M3突變體文庫的1152株菌進(jìn)行篩選,得到泳動(dòng)、酪蛋白酶活性、明膠酶活性、菌膜形成能力發(fā)生明顯變化的突變株1株(菌株6G_1)、3株(5A_11,7B_12,7E_12,)、1株(7H_1)、3株(5E_2、6A_2、6E_12)。進(jìn)一步分析顯示,一個(gè)磷酸二酯酶相關(guān)基因的突變引起泳動(dòng)能力增強(qiáng)(P0.05),leuD、rseB和thiQ的突變引起酪蛋白酶活性明顯減弱(P0.05),potD的突變引起明膠蛋白酶活性顯著減弱(P0.05),leuO、ilvH和grpB的突變引起菌膜形成能力明顯減弱(P0.05)。綜上所述,本研究從環(huán)境和基因水平未能找到激活鰻弧菌M3 T6SS的因子,找到8個(gè)影響鰻弧菌M3運(yùn)動(dòng)、蛋白酶活性、菌膜形成等毒力相關(guān)的基因,為進(jìn)一步研究鰻弧菌的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S941.4
【圖文】：

15C D 4-1 鰻弧菌 MHK3 lacZ::T6SS 和 M3 lacZ::T6SS 融合菌株的構(gòu) 4-1 Construction of fusion strain MHK3 lacZ::T6SS and M3 lacZ::TMHK3 T6SS 基因簇同源臂 DNA。M: DNA 2k plusΙΙ Marker；1 和組 DNA 為模板擴(kuò)增得到的 DNA 條帶，示擴(kuò)增 DNA 大小為 119 MHK3 lacZ::T6SS。M: DNA 2k plusΙΙ Marker；1 和 2，以 MHK3模板擴(kuò)增得到的 DNA 條帶，示擴(kuò)增 DNA 大小為 1033bp。

18圖 4-2 鰻弧菌 MHK3 lacZ::T6SS 在不同抗生素濃度脅迫下的生長柱狀圖中不同的字母表示差異顯著（p < 0.05）Fig 4-2 Growth of V. anguillarum MHK3 lacZ::T6SS under different concentrations of variousantibiotics

圖 4-2 鰻弧菌 M3 lacZ::T6SS 在不同抗生素濃度脅迫下的生長柱狀圖中不同的字母表示差異顯著（p < 0.05）Fig 4-2 Growth of V. anguillarum M3 lacZ::T6SS under different concentrations of variousantibiotics2.3.3M3 和 MHK3 的 T6SS 在抗生素脅迫下的表達(dá)在上述不同抗生素抑制鰻弧菌生長的情況下，我們檢測(cè)了 MHK3 lacZ::T6SS和 M3 lacZ::T6SS 的β-半乳糖苷酶活性，以明確抗生素脅迫是否影響鰻弧菌 T6SS的表達(dá)。結(jié)果顯示，四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素、多粘菌素的脅迫影響了MHK3T6SS 的表達(dá)，而 M3 在上述抗生素作用下 T6SS 均無檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性，在這些抗生素作用下無法激活 T6SS 功能。在沒有抗生素作用下， MHK3T6SS 在對(duì)數(shù)生長期的表達(dá)（2-12h）的表達(dá)逐漸升高，在平臺(tái)期（12-24h）的表達(dá)維持較低水平。在抗生素脅迫下，MHK3 T6SS 的表達(dá)在整個(gè)生長期間顯著下降（p<0.05）；脅迫濃度越大，MHK3 T6SS 的表達(dá)水平下降越明顯，當(dāng)四環(huán)素濃度為 1.0 μg/mL、鏈霉素為 10-15 μg/mL、羅紅霉素在 10-30 μg/mL、多粘菌素

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本文編號(hào)：2780682