【摘要】：維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii,A veronii)是一種人-獸-魚共患病原菌,它普遍分布于自然環(huán)境中,能引起魚蝦等多種水生動(dòng)物發(fā)病而大量死亡,部分國家已將其列為檢疫項(xiàng)目,國內(nèi)外已陸續(xù)開展了有關(guān)維氏氣單胞菌的科研工作。胞外產(chǎn)物(Extracellular products,ECPs)是病原菌在生長發(fā)育與繁殖過程中接連不斷向外環(huán)境分泌的產(chǎn)物,其具有良好的免疫原性,能夠引起宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),是一種有效的保護(hù)性抗原。目前國內(nèi)外還沒有維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物免疫效果的研究。本文以維氏氣單胞菌TH0426株為實(shí)驗(yàn)材料,制備其胞外產(chǎn)物,觀察胞外產(chǎn)物對錦鯉的免疫保護(hù)效果,同時(shí)對胞外產(chǎn)物進(jìn)行免疫蛋白組學(xué)分析,鑒定免疫原性蛋白。首先采用超濾濃縮法制備維氏氣單胞菌TH0426株的胞外產(chǎn)物,應(yīng)用SDS-PAGE電泳對其進(jìn)行初步分析,通過平板瓊脂擴(kuò)散法對其主要酶成分進(jìn)行初步研究,對蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脲酶、明膠酶和溶血活性進(jìn)行測定,同時(shí)對錦鯉腹腔注射胞外產(chǎn)物測定其致病性。結(jié)果表明維氏氣單胞菌TH0426株胞外產(chǎn)物具有脂酶、淀粉酶、蛋白酶和溶血酶活性,不具有卵磷脂酶、脲酶和明膠酶活性,對錦鯉具有明顯的致病性,其LD50為391.6μg/條。對胞外產(chǎn)物進(jìn)行免疫保護(hù)力研究。將240尾錦鯉分為四組,每組60尾。第一組免疫聯(lián)合弗氏佐劑的ECPs蛋白(即ECPs),第二組免疫聯(lián)合弗氏佐劑的ECPs與維氏氣單胞菌TH0426滅活全菌混合劑(即FKC+ECPs),第三組免疫聯(lián)合弗氏佐劑的維氏氣單胞菌TH0426滅活全菌(即FKC),第四組免疫滅菌PBS緩沖液作為對照。實(shí)驗(yàn)前預(yù)養(yǎng)一周,免疫后第三周進(jìn)行二次免疫,以觀察在加強(qiáng)免疫后的錦鯉免疫指標(biāo)變化。免疫期間每隔一周采血一次,每組隨機(jī)選擇5尾錦鯉進(jìn)行尾靜脈采血,采血后的錦鯉做淘汰處理,采集的血清進(jìn)行白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、溶菌酶(LZM)和IgM含量的檢測;首次免疫四周后,各組隨機(jī)選取20尾錦鯉腹腔注射0.2mL2×106cfu/mL的維氏氣單胞菌TH0426,觀察各組的相對免疫保護(hù)率,并評估其免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示免疫后各實(shí)驗(yàn)組錦鯉顯著提高抵抗細(xì)菌的侵襲的能力,提高了免疫保護(hù)力,并且免疫ECPs的效果較佳,其相對免疫保護(hù)率達(dá)到了75%,免疫FKC+ECPs和FKC的相對免疫保護(hù)率也達(dá)到了55%和70%。各免疫指標(biāo)也顯示免疫ECPs后能夠誘導(dǎo)錦鯉機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),并能形成較高保護(hù)力。胞外產(chǎn)物進(jìn)行了免疫蛋白組學(xué)2-DE圖譜分析和2-DE凝膠的免疫印跡分析,鑒定胞外產(chǎn)物中具有免疫原性的蛋白,并運(yùn)用PCR檢測三種免疫原性蛋白在維氏氣單胞菌不同分離株中的分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胞外產(chǎn)物含有11種具有免疫原性的蛋白,分別為肽酶S8、長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜蛋白、溶血素樣毒素、主要外膜蛋白OmpAI、麥芽糖、ABC底物結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和幾種假設(shè)蛋白。其中三種高豐度的蛋白,膜蛋白、長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和肽酶S8在維氏氣單胞菌不同分離株的分布率分別為97%(97/100)、89%(89/100)和77%(77/100)。這些免疫原性蛋白作為疫苗候選蛋白,為維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的研制提供了理論參考。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S941.4
【圖文】：

圖 3.1 雙向凝膠電泳原理圖[75]Fig3.1 Scheme of principle of 2D gel electrophoresis.[75備過程中蛋白質(zhì)的電荷不能有任何改變。這意劑，如 SDS，都不能使用。因此，必須依靠

圖 3.2 基于 2D 凝膠的蛋白質(zhì)組學(xué)原理圖[75]Fig3.2 Scheme of principle of 2D gel-based proteomics[75]學(xué)鑒定水平要高于鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)分析[84,85]。因此，基于

圖 1.1 蛋白含量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig1.1 Protein content detection standard curve酶活性檢測結(jié)果擴(kuò)散后，胞外產(chǎn)物酶活性試驗(yàn)結(jié)果表明，胞外產(chǎn)物在脂

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本文編號：2777706