【摘要】：鱖魚(yú)是我國(guó)主要的名特優(yōu)養(yǎng)殖魚(yú)類之一,自1994年傳染性脾腎壞死病毒病(infectious spleen and kidney necrosis virus disease,ISKNVD)暴發(fā)以來(lái),給我國(guó)鱖魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。因此,對(duì)其開(kāi)展深入研究非常必要。長(zhǎng)期以來(lái),受制于ISKNV敏感細(xì)胞系的缺乏,ISKNV致病機(jī)制等一直難以深入開(kāi)展,敏感細(xì)胞系的建立已成為研究該病的技術(shù)瓶頸。本研究針對(duì)上述問(wèn)題,首先開(kāi)展了ISKNV敏感細(xì)胞系的建立工作,建立了定量PCR快速檢測(cè)病毒含量技術(shù)、制備了識(shí)別病毒MCP的單克隆抗體,在此基礎(chǔ)上,深入開(kāi)展了ISKNV增殖復(fù)制與谷氨酰胺的關(guān)系。取得的結(jié)果如下:(1)鱖腦組織細(xì)胞系的建立針對(duì)鱖魚(yú)腦組織細(xì)胞的特征,采用膠原酶消化法分離腦組織細(xì)胞,進(jìn)行原代培養(yǎng),繼而成功構(gòu)建了鱖魚(yú)腦組織細(xì)胞系,命名為CPB(Chinese perch cell line)。目前該細(xì)胞系已傳了140多代,形態(tài)以成纖維樣細(xì)胞為主。CPB最適培養(yǎng)基為含10%血清的L15培養(yǎng)基,外源基因可以在CPB胞內(nèi)表達(dá)。病毒感染實(shí)驗(yàn)顯示,CPB對(duì)ISKNV高度敏感,不同代次細(xì)胞對(duì)病毒的感染滴度為6.58 6.62 log TCID50 ml-1;通過(guò)RT-PCR、免疫印跡、透射電鏡進(jìn)一步證實(shí)ISKNV可以感染CPB,在感染細(xì)胞內(nèi)觀察到大量的病毒粒子。魚(yú)體回歸感染實(shí)驗(yàn)顯示,病毒感染細(xì)胞上清對(duì)健康鱖魚(yú)高度致死,且隨著溫度的升高發(fā)病速度越快。(2)基于熒光定量PCR的ISKNV含量快速檢測(cè)方法研究利用基因重組技術(shù)成功將ISKNV的ORF007基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+質(zhì)粒中,命名為pcDNA007。然后針對(duì)ISKNV的ORF007基因,設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan探針,建立了ISKNV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。采用CPE法對(duì)連續(xù)10倍稀釋的ISKNV培養(yǎng)液的滴度進(jìn)行了測(cè)定,同時(shí)采用熒光定量PCR法測(cè)定病毒拷貝數(shù),結(jié)果顯示熒光定量PCR測(cè)定的病毒拷貝數(shù)與CPE法測(cè)定的病毒滴度具有良好的線性關(guān)系,其線性方程為y=1.076x+0.545(R2=0.9986),其中y為基因組拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù),x為病毒滴度TCID50的對(duì)數(shù)。表明熒光定量PCR法可替代CPE法應(yīng)用于病毒定量。(3)ISKNV主衣殼蛋白的單克隆抗體的制備及鑒定將大腸桿菌表達(dá)的重組MCP純化復(fù)性后,連續(xù)3次免疫BALB/c小鼠,然后將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,經(jīng)過(guò)克隆、篩選,獲得3株能穩(wěn)定分泌抗ISKNV MCP蛋白的單克隆抗體陽(yáng)性細(xì)胞株,分別命名為5F1、3D9和5B4,均為IgG1亞型。間接ELISA實(shí)驗(yàn)表明,3株單抗可特異性識(shí)別ISKNV,與鱖彈狀病毒、大鯢虹彩病毒等無(wú)交叉反應(yīng)。將5F1株免疫小鼠后制備腹水,以重組MCP和ISKNV細(xì)胞培養(yǎng)物上清液為檢測(cè)抗原,ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)分別為1∶51 200和1∶400。間接免疫熒光(IFA)和Western Blotting鑒定結(jié)果顯示,5F1能夠與ISKNV病毒發(fā)生特異性反應(yīng),并初步確定5F1單抗株制備的腹水用于IFA的使用濃度為1∶200、Western Blotting的使用濃度為1∶1000。結(jié)果證實(shí),成功制備了抗ISKNV MCP的單克隆抗體,可特異性識(shí)別ISKNV病毒粒子和MCP蛋白。(4)ISKNV增殖復(fù)制依賴于谷氨酰胺(Gln)的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)Gln是ISKNV復(fù)制增殖所必需的,Gln可以通過(guò)TCA循環(huán)回補(bǔ)代謝中間產(chǎn)物部分拯救病毒增殖。本章在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上,繼續(xù)對(duì)能完全拯救病毒增殖的TCA代謝中間產(chǎn)物進(jìn)行篩選,并對(duì)Gln是否還為病毒增殖提供能量ATP以及GSH進(jìn)行探討。結(jié)果顯示,當(dāng)添加谷氨酸脫氫酶抑制劑EGCG和谷胱甘肽合成途徑抑制劑BSO后,ISKNV的增殖復(fù)制被明顯抑制,病毒產(chǎn)量顯著下降;當(dāng)回補(bǔ)三羧酸循環(huán)(TCA)中間代謝產(chǎn)物、ATP以及還原性谷胱甘肽(GSHe)后,ISKNV的增殖被明顯拯救,其中檸檬酸拯救病毒增殖效果最好,ATP主要是促進(jìn)病毒釋放,而只有低劑量的GSHe對(duì)病毒增殖有促進(jìn)作用。上述結(jié)果說(shuō)明Gln可以通過(guò)谷氨酰胺酵解途徑為病毒增殖提供生物大分子和能量ATP,通過(guò)合成GSH為病毒增殖提供適量的氧化還原條件。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S943
【圖文】：

(A) (B)圖 2-1 不同代次 CPB 細(xì)胞形態(tài)特征。（A）第 15 代細(xì)胞；（B）第 66 代細(xì)胞。Fig. 2-1 Morphology of CPB cells. (A) Morphology of CPB cells at passage 15; (B)passage 66 (right).2.2.2 核型分析CPB 細(xì)胞在第 5 代和第 62 代分別做了核型分析，結(jié)果顯示在第 5 代時(shí) 93%的細(xì)胞含有 48 個(gè)染色體（圖 2-2A），第 62 代細(xì)胞的染色體數(shù)量在 28-56 中都有分布，其中細(xì)胞染色體重?cái)?shù)為 36、48 和 56（圖 2-2B）。從圖 2-2C 可以發(fā)現(xiàn)，有小部分細(xì)胞的染色體呈現(xiàn)非整倍體的、不對(duì)稱的分布，所有細(xì)胞與體外細(xì)胞染色體形態(tài)相似，都是端著絲點(diǎn)染色體。

(B)圖 2-1 不同代次 CPB 細(xì)胞形態(tài)特征。（A）第 15 代細(xì)胞；（B）第 66 代細(xì)胞Fig. 2-1 Morphology of CPB cells. (A) Morphology of CPB cells at passage 15; (Bpassage 66 (right).型分析B 細(xì)胞在第 5 代和第 62 代分別做了核型分析，結(jié)果顯示在第 5 代時(shí) 93 個(gè)染色體（圖 2-2A），第 62 代細(xì)胞的染色體數(shù)量在 28-56 中都有分布重?cái)?shù)為 36、48 和 56（圖 2-2B）。從圖 2-2C 可以發(fā)現(xiàn)，有小部分細(xì)胞倍體的、不對(duì)稱的分布，所有細(xì)胞與體外細(xì)胞染色體形態(tài)相似，都是

胞最適培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基、不同濃度 FBS 培養(yǎng) CPB 細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。從圖細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似拋物線，其中 L-15 培養(yǎng)基培養(yǎng)至 4 天時(shí)，細(xì)胞量最高/毫升，因此 L15 為最佳培養(yǎng)基。 2-3(B)中可看出，分別添加 10%、8%、6%和 4%血清的試驗(yàn)組，細(xì)胞均量然后開(kāi)始數(shù)量減少，細(xì)胞處于衰退期。添加 2%血清的試驗(yàn)組細(xì)胞增濃度組細(xì)胞增殖速度最快，細(xì)胞數(shù)量最高，因此，10%血清含量最適合

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本文編號(hào)：2777654