發(fā)布時間：2020-08-01 11:06

【摘要】：本實驗選取中國對蝦新品種“黃海2號”為實驗對象,以干熱、60Coγ射線和雙乙烯亞胺(binary ethyleneimine,BEI)滅活的白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)為媒介,誘導中國對蝦產生免疫致敏(immune priming)反應;并分析比較不同誘導方式對二次感染WSSV后對蝦死亡率、平均存活時間及相對免疫保護率的影響,并分析了可能與免疫致敏反應相關的FcDscam基因在組織和時空上的變化規(guī)律,以期探究中國對蝦免疫致敏反應的發(fā)生機制,為對蝦疾病的預防探尋新的方法。具體研究內容如下:本實驗擬探究經熱滅活的WSSV能否誘導中國對蝦產生免疫致敏反應。實驗將患有典型白斑綜合征癥狀的對蝦取腹部肌肉剁碎后經60℃滅活1 h,采用單尾定量口飼的方法,連續(xù)6 d投喂不同水溫條件(15℃、23℃、28℃、32℃)下的實驗組對蝦(E15℃、E23℃、E28℃、E32℃);同時設置常溫(23℃)條件下陽性對照組C23℃(投喂未經滅活的WSSV毒餌)、對照組CF23℃(只投喂商業(yè)配合飼料)。在實驗第13d對存活個體進行第二次人工WSSV感染,結果顯示,WSSV經60℃處理1 h可徹底失活,表現(xiàn)為連續(xù)投喂6天至第二次人工感染期間無對蝦死亡,而陽性對照組C23℃死亡率為100%。截止實驗第19 d,E15℃、E23℃、E28℃、E32℃各組存活率分別為80.41%、33.29%、8.47%、16.43%,CF23℃組的存活率為8.89%,E15℃組與其它各實驗組差異極顯著(P0.01),E23℃與CF23℃、E28℃、E32℃組差異顯著(P0.05),E28℃和E32℃組差異不顯著(P0.05);對各組實驗材料進行WSSV絕對熒光定量檢測,結果顯示,經熱滅活WSSV誘導的中國對蝦二次感染WSSV后,28℃環(huán)境下病毒的增殖速度最快,高溫(32℃)和低溫(15℃)都會不同程度抑制WSSV的增殖速率。實驗證明,熱滅活WSSV可以誘導中國對蝦產生免疫致敏反應,對感染WSSV后的中國對蝦具有一定的保護作用;溫度與WSSV的增殖速率密切相關。通過同源克隆和RACE技術獲得了中國對蝦(F.chinensis)Dscam基因cDNA序列全長,并對該序列進行生物信息學分析。結果顯示,中國對蝦Dscam基因全長6624 bp,其中包括171 bp的5’端非編碼區(qū)(5’UTR),459 bp的3’端非編碼區(qū)(3’UTR);開放閱讀框(ORF)的長度為5994 bp,共編碼1997個氨基酸,命名為FcDscam。該基因編碼的蛋白含有一個信號肽(signal peptide)、10個Ig(immunoglobulin,Ig)結構域,6個FNIII(fibronectin type III,FNIII)功能區(qū),1個胞質尾區(qū)(cytoplasmic tail),1個跨膜結構域(transmembrane domain)。經同源比對和系統(tǒng)進化樹分析,凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)與中國對蝦的相似性最高,為92.4%,在系統(tǒng)進化樹中,先與凡納濱對蝦聚為一支,然后同其它幾種甲殼動物紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)、通訊螯蝦(Pacifastacus leniusculus)、普通濱蟹(Carcinus maenas)和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)聚為一大支。連續(xù)投喂6 d熱滅活WSSV餌料誘導免疫致敏反應,在0 d,6 d,12 d及二次感染后12 h,24 h,48h,72 h,168 h分別取樣,用RT-PCR的方法檢測FcDscam相對表達量。結果顯示,FcDscam基因在第12 d開始上調,與對照組差異顯著(P0.05);二次感染后24 h,相對表達量達到最大值,與對照組差異極顯著(P0.01);48 h后基因表達量開始下降。實驗表明,中國對蝦存在Dscam基因,并在免疫致敏過程中發(fā)揮重要作用。為了探究如何有效的誘導對蝦等無脊椎動物的免疫致敏反應,實驗通過物理方法60Coγ輻照滅活患典型白斑綜合征的對蝦肌肉,連續(xù)10 d投喂滅活的WSSV餌料;使用化學試劑雙乙烯亞胺滅活白斑綜合征病毒懸液,在實驗第1 d和6 d注射滅活的WSSV病毒懸液,10 d后將誘導存活的個體均分為注射感染組和口飼感染組,并分別設置陽性對照和陰性對照,分別進行二次感染。二次感染7 d,γ-射線誘導組相對免疫保護率為20.94%(口飼)和13.64%(注射);BEI滅活誘導組相對免疫保護率為45.23%(口飼)和11.11%(注射)。在免疫誘導階段,0 d,3 d,6 d和10 d及二次感染后0 h(10 d),6 h,12 h,24 h,48 h取BEI滅活組樣品,通過實時熒光定量PCR分析Dscam基因時空和組織表達特征。結果發(fā)現(xiàn),BEI第一次注射誘導后3 d,血淋巴中Dscam基因相對表達量開始上調,在第10 d達到誘導階段的最大值,與WSSV感染組和PBS組差異顯著(P0.05)。二次注射和飼喂感染后,血淋巴中Dscam基因的表達量一直維持在較高水平,顯著高于對照組(P0.05)。且兩種感染方式下存活個體Dscam基因的相對表達量達到最大值。綜上所述,γ-射線和BEI都可以有效的滅活WSSV,并且可以誘導免疫致敏反應的發(fā)生,且這種免疫保護對飼喂和注射感染都有效。Dscam可以被滅活的WSSV誘導上調,這說明Dscam可能與免疫致敏密切相關。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S945.4
【圖文】：

protein)和 Toll 樣受體，這些模式識別受體在研究中都被發(fā)現(xiàn)具有特異性的結合特性和免疫功能。圖1-1 幾種IgSF類分子結構示意圖[56]Fig.1-1 The molecular structure of several kinds of IgSF5.2 類免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn)無脊椎動物被認為不能產生免疫球蛋白，但是近年來的研究證實無脊椎動物體內存在免疫球蛋白超家族分子。章躍陵等在日本囊對蝦和凡納濱對蝦的血清中

圖 1-2 Dscam 與脊椎動物免疫球蛋白的差異比較[67]Fig.1-2 The compare of formation between Dscam and immunoglobulin in vertebrateam 基因的可變剪切物的進化過程中，為了適應復雜多變的環(huán)境，生物體進化出了在有限得到結構復雜性和生理復雜性的機制，蛋白質的多樣性可以通過許調節(jié)，可變剪切是一個主要的調節(jié)機制(或選擇性剪接， altern)[68]，除此之外的調節(jié)機制還有基因組多樣性（基因家族）、外顯子重排(g)、體細胞高頻突變(somatic hypermutation)和體細胞基因外顯子重排等樣性的產生機制可能是無脊椎動物產生免疫致敏的先決條件。有些mRNA 前體可以通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點）產生不剪接異構體（圖 1-3），可變剪切是導致真核生物基因和蛋白質數(shù)量較原因。有研究表明，70%RNA 前體都有通過可變剪切產生復雜 mRN[69]。在脊椎動物的免疫防御系統(tǒng)中，T 細胞的激活和 T 細胞內穩(wěn)態(tài)

上海海洋大學碩士學位論文沒有充足的研究來證明。僅有研究證明與 mRNA 形成和成熟有關的絲富集蛋白 B52 的沉默降低了 Dscam 基因 Ig7 區(qū)域的可變性，B52 基因scam 等基因的可變剪切，作為一個可變剪切的正向調控基因來規(guī)范可動[71]。無脊椎動物受到不同病原體刺激形成不同 Dscam 亞型的機制是目前的研究還非常少，我們還需要更多的研究來了解 Dscam 是如何與、其吞噬作用和特異性識別的機理、表達動力學以及如何形成多變的亞

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