【摘要】：Bim是Bcl-2凋亡蛋白家族中僅有一個(gè)BH3同源結(jié)構(gòu)域的蛋白,能夠和Bcl-2家族中一些促生存亞家族成員如Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL結(jié)合,中和其活性,因此Bim被稱作Bcl-2家族促生存成員的死亡配體,Bim和Bcl-2促生成蛋白因子的比例與Bim誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。此外Bim蛋白還能夠上調(diào)Bax亞家族促凋亡蛋白水平。在哺乳動(dòng)物中,Bim前體mRNA由于不同的剪接方式會(huì)形成三種亞型:即 BimS(Bim short)、BimL(Bim long)、BimEL(Bim extra long)。一般情況下,BimEL含量最高,BimS含量最少,但是BimS促凋亡活性最強(qiáng)。金魚(Carassius auratus),屬于鯉科魚類,早在南宋時(shí)期就作為觀賞魚類飼養(yǎng)。金魚是低氧耐受能力最強(qiáng)的淡水魚類之一,具有鰓形態(tài)重塑等獨(dú)特的低氧適應(yīng)機(jī)制。在缺氧、溫水甚至運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,金魚鰓間嵌入式細(xì)胞團(tuán)(InterlamellarCell Mass,ILCM)減少,使鰓表面積增加,從而顯著增加對水體中溶解氧的吸收能力。在鯽魚和金魚中發(fā)現(xiàn)的鰓形態(tài)的可塑性后,一些魚類可逆地重塑鰓形態(tài)的能力己經(jīng)成為研究重點(diǎn)。HIF-1α通常被認(rèn)為是許多低氧誘導(dǎo)反應(yīng)的主要開關(guān),在缺氧環(huán)境中HIF-1α穩(wěn)定且表達(dá)升高。多種miRNA具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,miR-24就是其中之一,并且miR-24的表達(dá)受低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的誘導(dǎo),而Bim是miR-24下游的一個(gè)靶基因。目前,金魚ILCM凋亡分子機(jī)制尚不明確,研究Bim基因?qū)痿~適應(yīng)低氧和高溫環(huán)境中ILCM凋亡機(jī)制的影響,對闡明金魚適應(yīng)低氧與高溫的作用機(jī)理具有重要的意義。另外,對金魚鰓形態(tài)可逆性重塑的研究,為通過基因工程培育抗逆性強(qiáng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖新品種提供有益思路。為了探究Bim基因?qū)痿~鰓間ILCM細(xì)胞凋亡作用,本研究主要運(yùn)用DNA重組技術(shù)、熒光定量PCR、Western Blot和RNApull-down等實(shí)驗(yàn)技術(shù)展開研究,具體內(nèi)容如下:1.金魚Bim基因克隆及抗體制備PCR克隆金魚Bim基因編碼區(qū)序列,獲得兩條長度為546bp和213bp的Bim CDS區(qū)序列,編碼蛋白分別為182、71個(gè)氨基酸,推測是由于Bim基因不同的剪切形式形成的兩種Bim亞型。通過對金魚、斑馬魚和人的Bim氨基酸序列比對,選擇肽鏈“VARELRRIGDEFNRLYC”作為制備金魚Bim特異性抗體的抗原決定簇,成功獲得特異性的Bim抗體。利用3'RACE技術(shù)擴(kuò)增出長2952bp的Bim 3'-UTR序列,并構(gòu)建pGEM-T-Bim-3'-UTR載體,序列分析表明金魚Bim mRNA 3'UTR 區(qū)包含 9 個(gè)富含 AU 的元件(AUUU～UA,AU-rich elements,AREs)。2.miR-24及Bim在金魚低氧適應(yīng)中的差異性表達(dá)分析取健康金魚隨機(jī)分組,每組6條,分常氧組(溶氧量為8.5～9.5ppm)、低氧組(溶氧量1.8～2.1ppm)、低氧ERK抑制劑組培養(yǎng)8h后,解剖取樣。取魚鰓組織用戊二醛固定,經(jīng)過脫水與干燥后,用超景深顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與常氧條件相比,低氧條件下金魚鰓間ILCM明顯減少,而12.5 mg/kg ERK抑制劑處理可部分抑制低氧條件下金魚鰓間ILCM細(xì)胞團(tuán)的減少。熒光定量PCR分析表明,低氧能顯著提高金魚miR-24表達(dá)水平,同時(shí)金魚鰓組織中BimmRNA水平無顯著差異。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測Bim蛋白表達(dá)情況,低氧條件下,Bim蛋白表達(dá)量較常氧處理組下降,注射ERK抑制劑導(dǎo)致Bim蛋白水平顯著上升。由此推測,在低氧環(huán)境中miR-24的過表達(dá)和ERK1/2激酶的激活降低Bim的蛋白水平,從而促進(jìn)金魚ILCM細(xì)胞團(tuán)的減少,ERK抑制劑處理可抑制低氧誘導(dǎo)的Bim蛋白水平的降低,和金魚鰓組織ILCM細(xì)胞團(tuán)的減少。3.金魚溫度脅迫中Bim表達(dá)分析及RNAPull-down分析取健康金魚隨機(jī)分組,分別設(shè)置溫度為10℃、17℃、25℃的培養(yǎng)組,每組6條,培養(yǎng)24h后,解剖取樣。熒光定量PCR分析表明,隨著溫度升高,BimmRNA和蛋白相對表達(dá)水平降低。為進(jìn)一步探索不同溫度影響B(tài)im mRNA水平的原因,我們采用RNApull-down法分析不同溫度對熱休克蛋白HSC70和HSP40與Bim mRNA結(jié)合的影響。我們克隆出了金魚HSC70和HSP40基因并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-HSC70 和 pET32a-HSP40,通過 IPTG 誘導(dǎo)原核表達(dá)獲得 Trx-HSC70 和 Trx-HSP40重組蛋白。用Sal Ⅰ限制性內(nèi)切酶對pGEM-T-Bim-3'-UTR進(jìn)行單酶切得到線性Bim 3'-UTR DNA,通過體外轉(zhuǎn)錄和生物素標(biāo)記獲得Biotin-Bim-3'-UTR RNA,親和素樹脂富集Biotin-Bim3'-U,RNA后,向樹脂中加入等量要檢測的Trx-HSC70 或 Trx-HSP40 蛋白,分別置于 10℃、17℃、25℃搖床上孵育 3h。Westem blot分析不同溫度下HSC70與Biotin-Bim3'-UTR RNA結(jié)合能力的差異。在HSP40蛋白協(xié)同作用下,在一定范圍內(nèi),溫度越高,HSC70蛋白結(jié)合BimmRNA3'-UTR區(qū)的能力越弱。表明高溫降低了 HSC70蛋白與Bim mRNA 3'-UTR區(qū)的結(jié)合水平,從而抑制了 HSC70對Bim mRNA的穩(wěn)定作用,這也與25℃處理下Bim蛋白水平的降低吻合。本研究表明低氧與高溫分別通過ERK/miR-24和HSC70/HSP40抑制Bim的表達(dá)水平,并誘導(dǎo)金魚鰓組織ILCM細(xì)胞團(tuán)的減少。Bim同時(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生存的雙重調(diào)節(jié)功能,推測在金魚ILCM細(xì)胞團(tuán)中Bim主要發(fā)揮促細(xì)胞生存作用。Bim雙重調(diào)節(jié)功能的具體作用機(jī)制可能與特定細(xì)胞類型有關(guān),還需要進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

絲裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）途徑是細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。該途逡逑徑是由ＲＡＦ、ＭＥＫ邋（ＭＡＰ－ＥＲＫ激酶）和ＥＲＫ邋（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）激酶組逡逑成的三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖１．２）。在正常細(xì)胞中，ＲＡＳ激活ＲＡＦ激酶，活化的逡逑ＲＡＦ依次磷酸化并激活ＭＥＫ１和ＭＥＫ２，ＭＥＫ１和ＭＥＫ２在激活后磷酸化ＥＲＫ１逡逑６逡逑

３．１金魚鰓組織總ＲＮＡ提取逡逑ＲＮＡｉｓｏ邋Ｐｌｕｓ提取金魚鰓組織總ＲＮＡ，邋１％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＲＮＡ提取質(zhì)逡逑量（如圖２．１）。從圖中可以看出１８ＳＲＮＡ條帶明亮清晰，５ＳＲＮＡ的條帶較暗，逡逑說明提取的ＲＮＡ完整性好，降解程度低，可用于后續(xù)基因克隆實(shí)驗(yàn)。逡逑圖２．１金魚鰓組織ＲＮＡ提取逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｆｒｏｍ邋ｇｉｌｌ邋ｏｆ邋ｇｏｌｄｆｉｓｈ逡逑３．２金魚Ｂｉｍ基因ＣＤＳ區(qū)序列克隆逡逑３．２．１邋Ｂｉｍ邋ＣＤＳ序歹丨Ｊ擴(kuò)增逡逑以金魚ｃＤＮＡ為模板，用引物ＢｉｍＳ－Ｆｌ、ＢｉｍＳ－Ｒｌ進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，以ＢｉｍＳ－逡逑Ｆ２和ＢｉｍＳ－Ｒ２為引物進(jìn)行第二輪ＰＣＲ（圖２．２ａ），邋ＢｉｍＳＦ４－ｌ和ＢｉｍＳＲ４－ｌ用于最逡逑１９逡逑

逡逑后一輪ＰＣＲ擴(kuò)增，結(jié)果如圖２＿２ｂ，在５００ｂｐ和３００ｂｐ附近均有明亮條帶，這可逡逑能與Ｂｉｍ基因有幾種亞型相關(guān)，將兩條明亮條帶額分別割膠回收，為接下來構(gòu)逡逑建克隆載體做準(zhǔn)備。逡逑ａ邐ｂ逡逑，~T％~枺擔(dān)埃埃猓椋懼錡＾}鑛 ｆｔ邋．邋．逡逑ｉ000ｂｐ＾＾Ｓ＾｜逡逑７５０ｂｐ邐，００ｂｐ逡逑＾ｓｏｂｐ逡逑圖２．２金魚Ｂｉｍ基因ＣＤＳ區(qū)擴(kuò)增逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｂｉｍ邋ＣＤＳ邋ｉｎ邋ｇｏｌｄｆｉｓｈ逡逑（ａ）ＢｉｍＣＤＳ邋區(qū)巢式邋ＰＣＲ邋第二輪，Ｍ：邋ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１：以邋ＢｉｍＳ－Ｆ２邋和邋ＢｉｍＳ－Ｒ２逡逑為引物擴(kuò)增；（ｂ）ＢｉｍＣＤＳ邋區(qū)巢式邋ＰＣＲ邋最后一輪，Ｍ：邋ＤＬｌＯＯＯＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１：以邋ＢｉｍＳ－逡逑Ｆ４和ＢｉｉｎＳ－Ｒ４為引物擴(kuò)增逡逑（ａ）Ｓｅｃｏｎｄ邋ｒｏｕｎｄ邋ｏｆ邋ｎｅｓｔｅｄ邋ＰＣ＆邋Ｍ．．ＤＬ２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｂｉｍ邋Ｓ－Ｆ２／Ｓ－Ｒ２邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ逡逑ｆｏｒ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；邋（ｂ）Ｔｈｅ邋ｆｉｎａｌ邋ｒｏｕｎｄ邋ｏｆ邋ｎｅｓｔｅｄ邋ＰＣＲ，邋Ｍ：ＤＬ１０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；ｌ：邋Ｂｉｍ邋Ｓ－Ｆ４／逡逑Ｓ－Ｒ４邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｆｏｒ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑１２．２邋Ｂｉｍ－ｐＭＤ邋１９丁克隆載體構(gòu)建逡逑將割膠回收的５００邋ｂｐ左右的目的片段命名為Ｂｉｍｉ，３００邋ｂｐ片段命名為Ｂｉｍ２，逡逑將兩個(gè)片段分別連接到ｐＭＤ１９Ｔ邋ｅａｓｙ載體上

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 秦佳;楊金瑩;伊淑瑩;劉箭;;熱激蛋白對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用[J];生命科學(xué);2007年02期

本文編號(hào)：2773234