【摘要】：錦鯉皰疹病毒病(Koi herpes virus disease,KHVD)是危害養(yǎng)殖鯉最為嚴(yán)重的病毒性疾病,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報的疾病,我國將其列為二類動物疫病。KHV具有高度傳染性,毒力強(qiáng),感染錦鯉、鯉及其普通變種。目前KHV的檢測方法大都需要昂貴的儀器設(shè)備,且操作復(fù)雜,需要專業(yè)技術(shù)人員操作,不能滿足現(xiàn)場快速診斷的要求。因此,目前亟需建立一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、結(jié)果判定直觀、成本低廉的現(xiàn)場快速檢測方法,為疾病的防控提供技術(shù)支撐。本論文對錦鯉皰疹病毒病的國內(nèi)外流行現(xiàn)狀、檢測方法以及交叉引物技術(shù)的原理和應(yīng)用等進(jìn)行了闡述,研究與建立了一種與膠體金標(biāo)記的核酸快速檢測試紙條相結(jié)合的錦鯉皰疹病毒單交叉引物等溫擴(kuò)增的可視化檢測方法。本論文研究的主要內(nèi)容如下:1.引物設(shè)計及病毒DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建。根據(jù)錦鯉皰疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(DNA polymerase,Sph)基因,設(shè)計了一組單交叉擴(kuò)增引物,包括交叉引物2a1s,探針引物2a(2a-Bio)、3a(3a-FIT),剝離引物4s、5a。利用錦鯉鰭條組織細(xì)胞系Koi-Fin培養(yǎng)增殖KHV,提取病毒基因組DNA。以4s、5a為引物和KHV基因組DNA為模板擴(kuò)增KHV Sph基因的部分片段,然后將該基因片段克隆連接p MD#174;-19T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒p MD#174;-19T-Sph,作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板。2.建立交叉引物等溫擴(kuò)增(cross priming amplification,CPA)的基礎(chǔ)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,并對其進(jìn)行了優(yōu)化,最終建立了KHV單交叉引物等溫擴(kuò)增(single cross priming amplification,SCPA)KHV-SCPA方法。本實(shí)驗(yàn)依次優(yōu)化了引物濃度比例、Mg2+濃度、d NTPs濃度、Betaine濃度、Bst DNA聚合酶用量以及反應(yīng)溫度和擴(kuò)增時間。最佳反應(yīng)體系各成分終濃度為:1×Thermo Pol#174;Reaction Buffer,交叉引物2a1s 1.0μmol/L,探針引物2a(2a-Bio)、3a(3a-FIT)各0.5μmol/L,剝離引物4s、5a各0.6μmol/L,Mg2+濃度8.0 mmol/L,d NTPs濃度1.2 mmol/L,Betaine濃度0.7 mol/L,Bst DNA聚合酶用量5.6 U,模板DNA 1μL,無核酸酶水補(bǔ)足至25μL。最佳反應(yīng)溫度為63℃,最佳擴(kuò)增時間為60 min,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳呈現(xiàn)梯形條帶。3.KHV-SCPA特異性檢測及靈敏度測定。提取錦鯉皰疹病毒KHV、鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)、鰻鱺皰疹病毒(Ang HV)、大鯢虹彩病毒(GSIV)、白斑綜合征病毒(WSSV)以及細(xì)菌病原嗜水氣單胞菌(Ah)基因組DNA,進(jìn)行特異性檢測實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,KHV-SCPA檢測方法可特異性檢測出KHV。將常規(guī)PCR的檢測靈敏度與本研究建立的KHV-SCPA檢測靈敏度進(jìn)行比較,結(jié)果表明,KHV-SCPA檢測方法靈敏度較之常規(guī)PCR法高出約1 000倍。與膠體金標(biāo)記的核酸快速檢測試紙條相結(jié)合,在3~5 min內(nèi)可對等溫擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測。綜上所述,本研究建立的KHV-SCPA檢測方法可在63℃下60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增,特異性地檢測出KHV,靈敏度較之常規(guī)PCR方法高出約1 000倍。結(jié)合核酸試紙條檢測技術(shù),在3~5 min內(nèi)可對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測。KHV-SCPA檢測方法不依賴昂貴的儀器設(shè)備與專業(yè)技術(shù)人員,可應(yīng)用于錦鯉皰疹病毒的現(xiàn)場快速檢測中,為錦鯉皰疹病毒病的準(zhǔn)確快速診斷和有效防控提供了技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S943
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文檢測試紙條、一次性核酸檢測裝置等）結(jié)合，可為現(xiàn)場快速檢測提供一個平臺，在分子診斷、檢驗(yàn)檢疫、生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

11圖 1-2 雙交叉引物擴(kuò)增技術(shù)原理圖Fig.1-2 The mechanism schematic of double crossing CPA reactiona選自文獻(xiàn)（Xu et al.,2012）2.1.1 交叉引物等溫擴(kuò)增（CPA）技術(shù)的擴(kuò)增原理CPA 擴(kuò)增體系包括交叉引物、特異引物（探針標(biāo)記后即為檢測引物）以及 Bs（Bacillus stearothermophilus）DNA 聚合酶，Bst DNA 聚合酶的鏈置換功能使得DNA 的連續(xù)循環(huán)擴(kuò)增得以實(shí)現(xiàn)。CPA 擴(kuò)增的主要步驟如下：1. 帶有交叉引物位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。正向交叉引物的 5’端與反向交叉引物的雜交識別序列相同。特異引物分別位于交叉引物的上游。特異引物的濃度低

光染料法中添加嵌入熒光染料（溴化乙錠、SYBR GreenⅠ光染料只與雙鏈 DNA 小溝結(jié)合，當(dāng)有擴(kuò)增產(chǎn)物生觀察熒光染料顏色由原來的橘黃色變?yōu)榫G色。檢測法膜層快速檢測試紙條以及一次性核酸檢測裝置等條結(jié)果。僅出現(xiàn)一條紅線（在質(zhì)控區(qū) C）時，判斷現(xiàn)兩條紅線：一條位于檢測區(qū)（T），另一條位于，即有反應(yīng)發(fā)生；如果無紅線出現(xiàn)，則說明檢測

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2771180