【摘要】：亞甲基藍(methylene blue,MB),是一種常用的噻嗪類染料。它的去一甲基、去二甲基與去三甲基的代謝產(chǎn)物分別為天青B(azure B,AZB)、天青A(azure A,AZA)、天青C(azure C,AZC)。亞甲基藍在水產(chǎn)上常用于水霉病的防治。然而,國外研究表明,亞甲基藍及其代謝物具有生殖毒性和“三致”作用。其在水產(chǎn)動物中的蓄積殘留會對非靶動物及人體存在潛在的危害。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一種跨膜蛋白,具有藥物外排作用,對藥物在機體內(nèi)的作用影響重大。藥物可以通過誘導或抑制P-糖蛋白的表達對另一種藥物產(chǎn)生作用,藥物因此療效提高或者毒性降低。目前,國內(nèi)外對亞甲基藍在水產(chǎn)動物體內(nèi)分布及消除規(guī)律的研究罕有報道,而且亞甲基藍在不同動物體內(nèi)代謝規(guī)律有差異。因此,本試驗以異育銀鯽為研究對象,采用高效液相色譜法對亞甲基藍及其代謝物進行檢測,探究亞甲基藍及代謝物在水產(chǎn)動物體內(nèi)的分布和消除規(guī)律;采用實時熒光定量法和免疫組織化學方法探究亞甲基藍對P-糖蛋白表達的影響,探究藥物與P-糖蛋白間的相互作用,為加強該藥物的管理和應用提供理論依據(jù)。本論文的主要研究及結果如下:(1)本研究建立了異育銀鯽成魚和魚苗體內(nèi)亞甲基藍及代謝物的檢測方法。MB、AZB、AZA、AZC在0.010~1.0 mg/L范圍內(nèi),線性關系良好,R20.9998,線性方程分別為y=0.3738x-0.4513,y=0.0442x-0.1672,y=0.0455x-1.1833,y=0.1124x-2.3458,檢測限為2.0μg/kg,變異系數(shù)小于10%。(2)以15 mg/L的亞甲基藍浸泡異育銀鯽成魚0.5 h后將其飼養(yǎng)于實驗室水族箱中,研究了常規(guī)用藥條件下亞甲基藍及其代謝物在異育銀鯽各組織中的分布及消除規(guī)律。采用高效液相色譜法檢測亞甲基藍及其代謝物在異育銀鯽組織中的濃度,DAS3.0藥物與統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。結果表明:血液中亞甲基藍、天青B、天青A達峰時間Tpeak分別為0.083、0.5和8h,峰濃度值Cmax分別為143.436、110.770和8.444μg/L。亞甲基藍、天青B、天青A在異育銀鯽4種組織中肝胰臟濃度最高,皮膚最低,腎臟含量高于肌肉,其中異育銀鯽肌肉和皮膚組織易蓄積亞甲基藍及代謝物,至64 d仍可以檢測到,組織中未檢測到天青C。(3)采用實時熒光定量法方法檢測了MB對異育銀鯽組織中P-糖蛋白m RNA表達的影響。結果表明,P-糖蛋白在肝臟的相對表達含量最高,皮膚組織次之,而在腎臟組織中最低。通過獨立樣本T檢驗得出,肝胰臟、腎臟和皮膚分別存在極顯著性差異(P0.01)。由此可以推斷,P-糖蛋白在異育銀鯽組織中廣泛存在,但在不同組織間的表達量有所差異。在基因水平上,藥物代謝組與空白組P-糖蛋白的相對表達均具有極顯著差異(P0.01)。在肝臟組織各代謝時間點的樣品P-糖蛋白的表達均低于空白組織,而腎臟和皮膚組織未呈現(xiàn)出相似的規(guī)律。采用免疫組織化學的方法檢測了MB對異育銀鯽組織中P-糖蛋白表達的影響。由免疫組化結果可以看出,空白組織中,P-糖蛋白在肝臟的光密度值最高,皮膚組織略高于腎臟組織。通過獨立樣本T檢驗得出,空白肝臟與空白皮膚與空白腎臟組織分別存在極顯著性差異(P0.01),而空白皮膚組織與空白腎臟組織光密度不存在顯著性差異(P0.05)。由此可以推斷,P-糖蛋白在異育銀鯽不同組織中表達量有所不同,在肝臟中表達量較高。亞甲基藍在藥物代謝的過程中對P-糖蛋白在肝胰臟、腎臟和皮膚組織的表達產(chǎn)生了一定影響。綜上,本文建立了同時檢測水產(chǎn)品中亞甲基藍及其3種代謝物的方法;亞甲基藍及代謝物天青A和天青B在異育銀鯽不同組織中達峰時間有差異,消除時間均較長,至64 d仍可以檢測到,組織中未檢測到天青C。P-糖蛋白在異育銀鯽不同組織中表達量有所不同,在肝臟中表達量較高。亞甲基藍在藥物代謝的過程中對P-糖蛋白的表達產(chǎn)生了一定影響。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S948
【圖文】：

超聲提取 15 min，4500 r/min 離心 5 min，取乙腈層于另一 50 ml 離心管中，殘留物中再加入 4 mL 乙腈，重復以上操作后合并乙腈層。提取物的凈化：在離心管中加入 10 mL 乙睛飽和過的正己烷，劇烈振蕩混合后，4500 r/min 離心 5 min，棄去正己烷層，加入 2 mL20%二甘醇，再加入 10 mL二氯甲烷，重復以上操作后取下層，40 ℃下旋轉蒸發(fā)至近干，用流動相定容至 1.5mL，過 0.22 μm 濾膜后，待測。1.3 實驗數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2010 計算并繪制標準曲線，進行回歸分析。2 實驗結果2.1 目標物質的色譜圖目標物質的的保留時間分別為 6.728、5.380、4.34 和 4.08 左右（見圖 1-1）。

參數(shù) 單位亞甲基藍 methyleneblue天青 B azure B 天青 AazureAParameters Unit肌肉muscle皮膚skin肌肉muscle皮膚skin肌肉muscle皮膚skinAUC(0-t)μg h/ kg 55006.41 38475.585 108478.83 73501.785 43213.005 30831.195AUC(0-∞)μg h/ kg 79114.14 96916.695 167717.4 135907.305 92704.815 39620.13MRT(0-t)h 679.713 783.438 703.753 807.729 776.881 831.021MRT(0-∞)h 1273.645 2387.955 1469.182 2164.351 2378.998 1236.727t1/2z h 757.321 1322.46 925.051 1542.751 1553.609 778.879Tmax h 192 4 0.083 4 768 4CLz/Fh kg/L 0.284 0.232 0.134 0.166 0.243 0.568Cmax μg/kg 76.450 63.468 130.100 121.470 45.297 31.031注: 同表 2-1Notes:The same with Tab.2-1

上海海洋大學碩士學位論文熒光定量 PCR 結果可以看出，在三組未用藥空白組織中，P-糖蛋白在肝表達含量最高，皮膚組織次之，而在腎臟組織中最低（見圖 3-1）。T 檢肝胰臟、腎臟和皮膚間存在極顯著性差異(P<0.01)。由此可以推斷，P-糖育銀鯽組織中廣泛存在，但在不同組織間的表達量有所差異。結果 異育銀鯽組織中 P-糖蛋白在 mRNA 水平的表達

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本文編號：2771132