【摘要】：水生呼腸孤病毒(Aquareovirus genus,Reoviridae)是危害魚類健康的重要病原之一,其中草魚呼腸孤病毒(Aquqreovirus C/Grass carp reovirus,GCRV)是草魚(Ctenopharyngodon idellus)出血病的致病病原,GCRV為非囊膜分節(jié)段雙鏈RNA(dsRNA)病毒。近幾十年來從草魚中先后分離鑒定出3種GCRV基因型(代表病毒株:I型,GCRV-873;II型,GCRV-HZ08;III型,GCRV-104)。GCRV I型基因組(GCRV Typle I)是由11條分節(jié)段(基因組片段)的dsRNA構(gòu)成,一直公認(rèn)其編碼12個(gè)蛋白;其中Segment7(S7)節(jié)段的上游編碼一個(gè)膜融合蛋白(Membrane fusion protein)NS16,下游編碼一個(gè)功能未知的蛋白NS31。本研究主要闡述I型GCRV-S7編碼特性(三順反子)及其編碼蛋白NS31與宿主細(xì)胞熱休克效應(yīng)的相互關(guān)系(NS31轉(zhuǎn)錄調(diào)控HSP70表達(dá))。主要研究內(nèi)容如下:1.GCRV-S7是病毒的一個(gè)三順反子(Tricistron)病毒核酸序列分析發(fā)現(xiàn)在GCRV-JX01-S7中,除了NS16和NS31的編碼閱讀框(Open reading frame,ORF)之外,還有第三個(gè)閱讀框的存在(195-518 nt),其編碼一個(gè)預(yù)測大小為11.93 kDa的蛋白(107 aa),暫命名為NS12;通過RT-PCR,免疫印跡,間接免疫熒光以及串聯(lián)質(zhì)譜等一系列實(shí)驗(yàn)證明NS12并不是一個(gè)假性基因(Pseudogene),其在病毒復(fù)制過程中有效表達(dá);通過表達(dá)動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)NS12在病毒感染中后期表達(dá)。蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)NS12與NS16一樣,也含有一個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域;膜蛋白組份分離實(shí)驗(yàn)說明NS12的確是一個(gè)膜相關(guān)蛋白,但NS12蛋白膜融合誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)說明NS12并不能夠直接誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的合胞體形成(膜融合)。同樣在其它水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus-A,B,G)的11株病毒中也發(fā)現(xiàn)NS12同源蛋白,說明NS12相似蛋白在Aquareovirus屬中廣泛存在(通過ATG或非ATG起始位點(diǎn)翻譯),在病毒感染過程中行使保守功能。以上結(jié)果說明GCRV-S7節(jié)段編碼3個(gè)蛋白,是呼腸孤病毒中一個(gè)新鑒定的三順反子,推測S7通過leaky-scanning和ribosome-shunting機(jī)制分別翻譯下游編碼蛋白(NS12和NS31)。2.在酵母中鑒定NS31的轉(zhuǎn)錄活性在分析S7節(jié)段編碼特性基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索其編碼蛋白NS31的功能:利用層析方法純化GCRV-JX01病毒粒子,原核表達(dá)純化NS31蛋白用于制備多克隆抗體,利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)NS31是病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白,其在病毒感染的中期開始表達(dá),這與外衣殼蛋白VP7和VP5表達(dá)基本一致;利用酵母報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)NS31是唯一一個(gè)GCRV編碼具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白(Transcription Activator);在酵母中融合蛋白NS31-BD的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性依賴于其全長的完整性,NS31蛋白的N-端和C-端與BD融合具有微弱的轉(zhuǎn)錄活性,并且NS31中段(131-214aa)調(diào)控(抑制)其自身轉(zhuǎn)錄功能,這一過程可能與其亞細(xì)胞定位特性有關(guān);并且NS31-BD在酵母中活化報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄依賴于BD結(jié)構(gòu)域。我們可推測NS31-BD融合蛋白通過BD結(jié)構(gòu)域直接靶向報(bào)告基因啟動(dòng)子,從而NS31像Gal4-AD一樣在酵母中活化報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。由于GCRV是dsRNA病毒,其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制裝配,其自身的基因組復(fù)制并沒有轉(zhuǎn)錄的步驟(DNA轉(zhuǎn)錄為RNA),故推斷NS31可能是參與宿主基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子。3.NS31選擇性轉(zhuǎn)錄調(diào)控宿主細(xì)胞熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)表達(dá)在酵母中NS31展現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,進(jìn)一步尋找NS31的可能性轉(zhuǎn)錄靶標(biāo):通過轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)NS31在CIK細(xì)胞中過表達(dá)能夠上調(diào)HSP70 mRNA水平,同時(shí)病毒感染12h和20h也能上調(diào)HSP70 mRNA水平;進(jìn)一步制備特異性識(shí)別草魚HSP70蛋白多克隆抗體,定量RT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明:在未感染GCRV魚類細(xì)胞中HSP70表達(dá)極低,難以檢測到;在NS31過表達(dá)或病毒感染的細(xì)胞(CIK和GCO)中,HSP70基因上調(diào)表達(dá)(轉(zhuǎn)錄及蛋白水平),并且GCRV感染細(xì)胞后檢測到HSP70蛋白表達(dá)隨著NS31表達(dá)逐漸升高;進(jìn)一步對HSPs家族基因(HSP30,HSP90,HSC70和HSF1等)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)NS31選擇性調(diào)控HSPs表達(dá)(僅有效誘導(dǎo)HSP70表達(dá))。克隆HSP70基因上游啟動(dòng)子區(qū)(2000bp左右),應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明NS31特異性調(diào)控HSP70啟動(dòng)子表達(dá);對NS31截?cái)囿w功能分析發(fā)現(xiàn)其C-端(1-74 aa)和N-端(214-274 aa)可能是調(diào)控HSP70表達(dá)的功能區(qū)域。依據(jù)本部分結(jié)果推測GCRV病毒通過NS31轉(zhuǎn)錄調(diào)控誘導(dǎo)宿主HSP70表達(dá)。4.NS31轉(zhuǎn)錄調(diào)控HSP70機(jī)制及其對病毒感染效率的影響本部分首先應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定NS31轉(zhuǎn)錄活化HSP70基因的核心啟動(dòng)子,發(fā)現(xiàn)HSP70翻譯起始位點(diǎn)上游-791/-429序列是NS31活化的必需位點(diǎn);同時(shí)利用EMSA實(shí)驗(yàn)闡明NS31(桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NS31蛋白)與HSP70核心啟動(dòng)子并不能夠體外直接結(jié)合;推測NS31可能通過與HSP70調(diào)控蛋白結(jié)合行使轉(zhuǎn)錄功能。利用pull-down聯(lián)合質(zhì)譜鑒定與NS31相互作用的宿主蛋白,其中發(fā)現(xiàn)NS31能夠與共轉(zhuǎn)錄因子p300相互作用;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)利用p300抑制劑或shRNA干擾技術(shù)敲降p300能夠抑制GCRV感染或NS31表達(dá)對HSP70表達(dá)的誘導(dǎo)作用,說明NS31調(diào)控HSP70轉(zhuǎn)錄依賴于p300共轉(zhuǎn)錄因子。最后利用HSP70抑制劑或HSP70過表達(dá)評估HSP70表達(dá)豐度對GCRV感染效率的影響,發(fā)現(xiàn)HSP70能夠促進(jìn)GCRV感染,其可能成為抗病毒靶標(biāo)的潛在因子。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S943
【圖文】：

圖 1-1 水生呼腸孤病毒粒子內(nèi)部結(jié)構(gòu)和基因組簡圖(圖片來源[23])Figure 1-1 Schematic of aquareovirus inner viron and genomealfoftheicosahedral capsidisremovedtoshowthestructuresofthegenomicdsRNt layer in orange and second layer in yellow), RdRp VP2 (magenta), and cofacto[23]

圖 1-2 RNA 病毒非經(jīng)典翻譯機(jī)制（圖片來源[36]）Figure 1-2 Non-canonical translational mechanisms in RNA viruses.Canonical eukaryotic mRNA translation is shown in the top panel. Red arrows indicatinitiation of protein synthesis (at the start of an ORF) or continuation of translation b

墻峁溝鞍住Ｈ繚?GCRV 中還編碼另外 3 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（圖1-3），NS38，NS31（推測）和 NS26;NS38 被 NS80 招募到病毒包涵體中[61]，能夠與內(nèi)衣殼蛋白 VP1-VP4，VP6 和 NS80-RNA 復(fù)合物相互作用，也能夠與宿主翻譯起始因子 3 相互作用（eIF3A），說明 NS38 和哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒 σNS 功能相似，可能參與病毒的包涵體形成，病毒組裝和病毒蛋白的翻譯等過程[71,72]；NS31 功能未知（僅發(fā)現(xiàn)存在于水生呼腸孤病毒屬）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 張奇亞;桂建芳;;水產(chǎn)動(dòng)物的病毒基因組及其病毒與宿主的相互作用[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2014年12期

2 方勤,肖調(diào)義,李旅,鄒桂平,章懷云,汪亞平;四株草魚呼腸孤病毒毒株的細(xì)胞感染特性比較研究[J];中國病毒學(xué);2002年02期

3 李軍,王鐵輝,陸仁后,陳宏溪;草魚出血病病毒的研究進(jìn)展[J];海洋與湖沼;1999年04期

4 鄧初夏;楊興棋;陳宏溪;;幾種魚類細(xì)胞對草魚呼腸孤病毒敏感性的研究[J];水生生物學(xué)報(bào);1985年04期

本文編號(hào)：2770915