發(fā)布時間：2020-07-25 09:43

【摘要】：嗅覺是動物感知外界的重要感知,在尋找食物、進行群體間交流、地理定位等行為中起到一定的作用。嗅覺功能的實現(xiàn)是基于嗅覺受體(olfactory receptors,OR)蛋白功能的實施,OR具有能夠識別并結(jié)合外界氣味分子的功能,此是引發(fā)嗅覺功能的起始階段。經(jīng)過長時間的進化,OR具有5個相互獨立的家族,其中的主嗅覺受體(main olfactory receptors,MORs)在數(shù)量上是最多的,并且具有識別、結(jié)合能夠溶于水的氣味分子。MOR蛋白由MOR基因表達,在此研究中刀鱭(Coilia nasus)的OR基因MOR-4K13和MOR-51I2屬于MOR基因,預(yù)測基因編碼的OR具有7次α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu),是G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCRs)超家族中的一員。已報道的研究認為嗅覺功能在魚類洄游行為中起到一定的作用,研究對象刀鱭具有兩種生態(tài)型:洄游型和定居型,其中洄游行為為生殖洄游。本研究就刀鱭OR基因的克隆、基因結(jié)構(gòu)、生物信息學(xué)分析、組織表達、系統(tǒng)進化和不同生態(tài)型OR間氨基酸序列的差異及系統(tǒng)進化關(guān)系等方便進行分析。為后續(xù)研究影響刀鱭洄游行為因素、洄游“嗅覺定向假說”和“嗅覺印記”等理論提供有用數(shù)據(jù)。1.刀鱭MOR-4K13基因的克隆及組織表達。采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)從洄游型靖江刀鱭嗅囊中獲得了MOR-4K13基因,獲得基因的長度為1098bp,具有963bp的開放閱讀框區(qū)域,位置在獲得基因51~1013bp范圍內(nèi),單外顯子結(jié)構(gòu),預(yù)測可編碼320個氨基酸。預(yù)測MOR-4K13基因編碼的氨基酸序列,可以形成7次α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu),屬GPCRs家族A,有膽固醇(cholesterol)和油酸(oleic acid)兩個天然配體,無信號肽結(jié)構(gòu),為非分泌蛋白,有一個二硫鍵結(jié)構(gòu),能夠被22個色氨酸(serine,S)激酶、27個蘇氨酸(threonine,T)激酶、17個酪氨酸(tyrosine,Y)激酶磷酸化修飾位點;同時具有8個protein類、5個DNA類和5個RNA類綁定位點。MOR-4K13蛋白是細胞質(zhì)膜組分,鑲嵌與質(zhì)膜內(nèi),部分結(jié)構(gòu)位于細胞外圍,同時具有跨膜信號受體、GPCRs、信號傳導(dǎo)、分子傳導(dǎo)、OR等活性,并且參與感覺化學(xué)氣味分子、信號傳導(dǎo)、細胞通訊、監(jiān)管生化過程、刺激細胞反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞、多細胞生物過程、生物調(diào)節(jié)等過程。序列同源性比較顯示,刀鱭mor-4k13基因編碼區(qū)序列與已報道的其他魚類or基因的同源性在65%~84%間,其預(yù)測編碼的蛋白與其他魚類or蛋白的同源性在40%~68%,與近緣種大西洋鯡(clupeaharengus)or4k13-like基因及編碼的蛋白同源性分別為77%和68%。在進化樹上兩者進化距離最近,處于同一小分支,在進化距離上與鮭形目、溕形目、雀鱔目、渶形目及鰈形目中魚類or基因及編碼的蛋白質(zhì)較遠。qrt-pcr分析顯示,mor-4k13基因在定居型鄱陽湖刀鱭嗅囊和性腺中高表達,在肌肉、眼球、胃壁、肝臟和鰓中低表達,心臟中幾乎不表達。洄游型靖江刀鱭嗅囊中的表達量總體高于定居型鄱陽湖刀鱭。這表明mor-4k13基因不僅與嗅覺功能和性腺發(fā)育相關(guān),也可能與生殖洄游習(xí)性相關(guān),不同性別的個體間也存在著嗅覺能力的差異。2.刀鱭mor-51i2基因克隆及組織表達。利用染色體步移技術(shù)從洄游型靖江刀鱭體內(nèi)克隆一條能夠編碼嗅覺受體蛋白的基因序列,命名為mor-51i2基因。該基因為單外顯子結(jié)構(gòu),開放閱讀框區(qū)域長999bp,在3′-utr區(qū)域具有微衛(wèi)星序列,以(ac)n為重復(fù)單位,但其中夾有若干t或g堿基,在不同種群中具有長度差異。mor-51i2基因能夠編碼332個氨基酸殘基,同樣能夠形成7次α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu),屬gpcrs家族a,具有一個二硫鍵結(jié)構(gòu),并無信號肽結(jié)構(gòu),具有被22個色氨酸(s)激酶、25個蘇氨酸(t)激酶、17個酪氨酸(y)激酶激酶磷酸化位點,有9個protein類、6個dna類和7個rna綁定位點,mor-51i2基因產(chǎn)物是細胞質(zhì)膜組分,鑲嵌與質(zhì)膜內(nèi),部分結(jié)構(gòu)位于細胞外圍,具有跨膜信號受體、gpcrs、信號傳導(dǎo)、分子傳導(dǎo)、or等活性。刀鱭mor-51i2基因序列與已經(jīng)報道過的其他魚類同源基因的同源性在66-85%之間,mor-51i2蛋白與已報道的其他魚類or蛋白的同源性在51%以上,其中與同為鯡形目的大西洋鯡(c.harengus)or51i2-like基因及蛋白同源性最高,在系統(tǒng)進化關(guān)系上兩者最近處于同一分支。qrt-pcr分析顯示,mor-51i2基因在定居型鄱陽湖刀鱭中主要在嗅囊和性腺中表達,而在胃、肝臟、鰓、肌肉、心臟和眼睛中幾乎不表達。其中,雌性嗅囊中的表達量約是其雄性嗅囊中的2倍,但洄游型靖江刀鱭嗅囊表達量總體上高于定居型鄱陽湖嗅囊,這些結(jié)果表明,mor-51i2基因不但與嗅覺功能有關(guān),也可能參與了刀鱭的性腺發(fā)育及生殖洄游過程,同時也可能與生態(tài)型的分化相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4;Q78
【圖文】：

2圖 1-1 刀鱭的水域分布(a 引自[9])Fig.1-1 The water distribution of C. nasus (Fig.a quoted from[9])1.1.2 刀鱭的資源狀況刀鱭是長江流域重要的中小型經(jīng)濟型魚類，是長江沿岸魚類群聚的優(yōu)勢種或次優(yōu)勢種[12]。每年四五月份刀鱭進入繁殖期，其具有很高的含脂量，肉質(zhì)比較細嫩鮮美，因此被追捧為是“長江三鮮”中的一鮮[3]。2002~2013 年間，漁汛期捕獲的刀鱭體長平均 12.36±3.70cm，體重平均 7.5±8.2g。年齡組成分別是幼體 78.9%、Ⅰ

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文的 GPCRs 受體，與溶于水中的化學(xué)分子結(jié)合后，細胞內(nèi) cAMP 濃度增加，促使環(huán)核苷酸門控通道(cyclic nucleotide gated，CNG)開啟，引起 Na+、Ca2+向細胞內(nèi)流動，使細胞膜產(chǎn)生去極化，并且 Na+、Ca2+內(nèi)流激活了細胞膜上的 Cl-通路促使 Cl-流出細胞，這種過程的結(jié)果就是使細胞膜進一步去極化(圖 1-2)[25]。產(chǎn)生的感受電位，經(jīng)感覺神經(jīng)傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過下丘腦-腦垂體-性腺軸的反饋調(diào)控，促使嗅覺感知行為的發(fā)生。對于上述對嗅覺相關(guān)方面的研究，1975 年 Kafka 等[26,27]提出可能存在 OR，而 Villet 推測 OR 是一種蛋白質(zhì)[28,29]。

達[46-48]。類型 1 可能用于辨別水中氣味分子，類型 2 則用[49]。魚類的 MORs 基因大多為類型 1。 基因與哺乳動物的犁鼻器Ⅰ受體(vomeronasal type-1 rece基因，只是 V1Rs 基因在犁鼻器系統(tǒng)(vomeronasal nervous 魚類不存在 VNS，ORA 只在 OE 感覺細胞中表達[50-52]。數(shù)目是最少的，但是其家族具有六個，以在不同的魚類中數(shù)量在不同的魚中也具有輕微的不同，如圖 1-5。 基因在哺乳動物中也叫犁鼻器Ⅱ受體(vomeronasal type3]，同 V1Rs 基因相同，V2Rs 基因也在 VNS 中表達。OlfC數(shù)目具有差異，如圖 1-6。Rs 能夠識別胺類物質(zhì)[54]，魚類 TAARs 基因家族在數(shù)量上-7)，TAARs 具有三種類型：ClassⅠ、ClassⅡ和 Class Ⅲ[s 基因在魚類中目前還未有研究。

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1 趙春來;陳文靜;張燕萍;王昌來;;刀鱭的生物學(xué)特性及資源現(xiàn)狀分析[J];江西水產(chǎn)科技;2007年02期

2 陳衛(wèi)境;顧樹信;;長江靖江段刀鱭資源調(diào)查報告[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2012年07期

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5 葉佳林;劉正文;王衛(wèi)民;;太湖梅梁灣刀鱭與間下(魚箴)食性的比較[J];湖泊科學(xué);2007年02期

6 袁傳宓,林金榜,劉仁華,秦安

本文編號：2769660