【摘要】：本文以斑馬魚為研究對象,通過亮甲酚藍(lán)染色法判斷卵母細(xì)胞成熟度和采用不同濃度、不同處理時(shí)間17α-羥基孕酮處理斑馬魚卵母細(xì)胞,對斑馬魚卵母細(xì)胞體外促成熟進(jìn)行研究;通過采用不同配方玻璃化凍存液凍存,并結(jié)合凍存后細(xì)胞存活率的檢測,對斑馬魚卵母細(xì)胞玻璃化凍存條件進(jìn)行篩選;通過檢測凍存后細(xì)胞中三種線粒體ATP酶(Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶)的活性和谷胱甘肽含量變化,對玻璃化冷凍保存對斑馬魚卵母細(xì)胞的損傷作用等進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:(1)比較通過亮甲酚藍(lán)染色法和卵母細(xì)胞直徑大小、細(xì)胞形態(tài)判斷卵母細(xì)胞成熟度的結(jié)果,判定亮甲酚藍(lán)染色法用于斑馬魚卵母細(xì)胞成熟度的評估可行且更便捷。篩選出亮甲酚藍(lán)染色濃度為20μmol/L、染色時(shí)間為150min的染色效果最佳。(2)實(shí)驗(yàn)以不添加17α-羥基孕酮的培養(yǎng)液為對照組,以濃度分別為1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L的17 a-羥基孕酮培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)組,對斑馬魚卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)6 h、12 h和24 h,以亮甲酚藍(lán)染色法評價(jià)卵母細(xì)胞的體外成熟情況。結(jié)果表明:1)17α-羥基孕酮對斑馬魚卵母細(xì)胞的存活率沒有明顯影響;2)17α-羥基孕酮濃度為1 nmol/L、10 nmol/L處理6 h,卵母細(xì)胞的成熟率分別為50.99%和44.30%,但與對照組比較差異不顯著,因此推斷低濃度的17α-羥基孕酮(1 nmol/L和10 nmol/L)對斑馬魚卵母細(xì)胞的成熟無明顯促進(jìn)作用;17α-羥基孕酮濃度為1000 nmol/L處理6 h,卵母細(xì)胞的成熟率分別為33.30%,與對照組相比成熟率下降明顯,說明高濃度的17α-羥基孕酮(1000 nmol/L)對卵母細(xì)胞的成熟反而不利;17α-羥基孕酮濃度為100 nmol/L、處理12 h后,成熟率為40.72%,顯著高于對照組(p0.05),對卵母細(xì)胞成熟有明顯的促進(jìn)作用。3)17α-羥基孕酮濃度在1-1000 nmol/L區(qū)間處理6小時(shí),斑馬魚卵母細(xì)胞半成熟的比率隨孕酮處理濃度的增加而增加,都高于對照組,且在100 nmol/L和1000nmol/L劑量組半成熟的卵母細(xì)胞比率分別達(dá)47.92%和56.48%,與對照組相比差異顯著(p0.05),說明17α-羥基孕酮對卵母細(xì)胞在成熟的過程中有一定的促進(jìn)作用,且孕酮濃度越大效果越明顯。(3)設(shè)置9組(V1~V9)配方不同的玻璃化液對斑馬魚卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化凍存(-196℃),分別檢測凍存1d、2d、4d和8d后卵母細(xì)胞的存活率,結(jié)果表明:V4組的存活率最高,且顯著高于其它組,其卵母細(xì)胞存活率在凍存1d、2d、4d和8d后分別為48.89±2.58%、39.35±1.34%、24.18±2.32%和14.56±1.64%,凍存1-2d效果較好,但隨著凍存時(shí)間的增加,卵母細(xì)胞存活率明顯下降;該玻璃化液組分是:1.5mol/L甲醇、6.0mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖。(4)對玻璃化凍存后斑馬魚卵母細(xì)胞的線粒體ATP酶的活性和谷胱甘肽含量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:1)各實(shí)驗(yàn)組Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶活性在凍存1d、2d、4d和8d后均顯著下降,其中V4組的各種酶活性相對較高,經(jīng)檢測其Ca2+-ATP酶活性在凍存1d、2d、4d和8d后分別為:3.823±0.144U/mgprot、3.492±0.084U/mgprot、2.554±0.097U/mgprot和1.930±0.076U/mgprot;Mg2+-ATP酶活性分別為4.503±0.144 U/mgprot、4.134±0.182U/mgprot、2.972±0.096U/mgprot和2.113±0.073 U/mgprot;Na+K+-ATP酶活性分別為7.520±0.198 U/mgprot、5.828±0.184 U/mgprot、3.204±0.197 U/mgprot和2.031±0.176 U/mgprot。2)各實(shí)驗(yàn)組的谷胱甘肽含量經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)也是隨著冷凍保存天數(shù)的增加而顯著下降,其中V4組的谷胱甘肽含量顯著高于其它組,其含量在凍存1d、2d、4d和8d后分別為13.37±0.59mgGSH/gprot、10.57±0.73 mgGSH/gprot、6.25±0.89 mgGSH/gprot和4.16±0.57 mgGSH/gprot。3)綜合分析各項(xiàng)檢測數(shù)據(jù)結(jié)果表明,細(xì)胞的活性隨著凍存天數(shù)的增加而逐漸下降,說明玻璃化凍存不能完全避免低溫和冷凍保護(hù)劑的毒性對卵母細(xì)胞造成損傷。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2769667