【摘要】：刺參生長面臨的主要環(huán)境應(yīng)激因素主要有溫度、鹽度、溶氧、感染、干露等過強(qiáng)的刺激會(huì)引起刺參機(jī)體免疫能力的下降、攝食能力減弱、生長速度減緩、排臟、暴發(fā)疾病等。但是現(xiàn)階段較為粗獷的室外池塘養(yǎng)殖方式,夏季高溫天氣、河口區(qū)域淡水注入、水體污染造成的細(xì)菌感染、以及刺參運(yùn)輸中受到干露刺激,在生產(chǎn)過程中都是無法避免的。本實(shí)驗(yàn)對3個(gè)刺參不同群體進(jìn)行比較,每個(gè)品系又分為大、小2種規(guī)格。小規(guī)格刺參重量為49.72±6.53 g,大規(guī)格刺參重量在97.58±18.12 g左右。在實(shí)驗(yàn)室中模擬這四種引起刺參應(yīng)激的因素,通過脅迫的實(shí)驗(yàn)方法來評價(jià)三個(gè)刺參群體的不同規(guī)格實(shí)驗(yàn)組的抗逆能力。也結(jié)合刺參生長率、死亡率和測定免疫酶活性的方式來評價(jià)”高抗1號”新品系刺參、非選育刺參1和非選育2三個(gè)刺參群體的經(jīng)濟(jì)性狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為,在高溫脅迫實(shí)驗(yàn)和低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)中,”高抗1號”新品系刺參都有良好表現(xiàn),成活率高、特定生長率較大、非特異性免疫酶活力較高等,特別是在高溫脅迫方面,“高抗1號”新品系刺參具有良好的抗高溫性狀。為研究周年水溫變化對“高抗1號”新品系刺參刺參活動(dòng)狀態(tài)和生理生化的影響,對6個(gè)刺參養(yǎng)殖池塘進(jìn)行為期一年的跟蹤,觀察記錄其攝食、排便、活動(dòng)軌跡,在水溫升高至刺參夏眠節(jié)點(diǎn)進(jìn)行腸道取樣測量消化酶(蛋白酶、淀粉酶、和脂肪酶)活性并且固定腸道樣品、制作石蠟切片。研究結(jié)果顯示,“高抗1號”新品系刺參較非選育刺參,有顯著的耐高溫性狀:夏眠期縮短約一個(gè)月。在水溫升至的28℃時(shí),消化道中蛋白酶、淀粉酶活力較高,差異顯著;脂肪酶不同溫度下其活力都很低,無顯著差異。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)之前學(xué)者研究的關(guān)于刺參高溫環(huán)境應(yīng)答的基因入手,從基因組學(xué)的角度出發(fā),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對溫度提高過程下刺參基因轉(zhuǎn)錄mRNA量的變化進(jìn)行測定。篩選出4種與熱應(yīng)激表達(dá)有關(guān)基因,類致死必需蛋白基因、熱休克蛋白基因、主要卵黃蛋白基因和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9基因。以β-actin為內(nèi)參,利用相對定量2-ΔΔct法,對這4個(gè)基因在不同溫度脅迫下的相對表達(dá)量進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)所用的刺參進(jìn)行高溫脅迫后,hsp70和l(2)efl相對表達(dá)量上升,再次證明了hsp70和l(2)efl為上調(diào)基因,當(dāng)水溫為27-30℃時(shí),hsp70和l(2)efl隨著溫度的升高其表達(dá)量增多,刺參耐熱性通過hsp70的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。在水溫為28℃高溫脅迫時(shí),hsp70和l(2)efl的上調(diào)表達(dá)明顯。進(jìn)行高溫脅迫之后myp和psck9相對表達(dá)量總體呈下降趨勢,myp和psck9為下調(diào)基因。水溫有27℃升至28℃時(shí),myp和psck9相對表達(dá)量下降顯著。在各個(gè)高溫脅迫時(shí),“高抗1號”新品系刺參的四種熱應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)水平與其它品系刺參存在差異。微衛(wèi)星標(biāo)記以實(shí)驗(yàn)提取的dna為模板,和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的64對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增,擴(kuò)增后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,根據(jù)條帶的有無篩選出符合條件的微衛(wèi)星dna引物。popgene32.0軟件統(tǒng)計(jì)分析每一個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(na)、有效等位基因數(shù)(ne)、觀測雜合度(ho)、期望雜合度(he)、基因流(nm)、香農(nóng)-威納指數(shù)(i)、hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)、群體間遺傳分化指數(shù)(fst)和nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(ds);genepop軟件進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn);piccalc0.6計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(pic);利用mega6.0繪制聚類分析圖。3個(gè)養(yǎng)殖群體刺參平均等位基因數(shù)、平均有效基因數(shù)均以gk群體刺參最高,分別為10和4.7070;ns2和ns1群體的等位基因都為9,ns1和ns2刺參品系的平均有效等位基因數(shù)分別為4.5260和4.1618。gk個(gè)體刺參期望雜合度和觀測雜合度最高,分別為0.7197和0.4714;ns2群體刺參的觀測雜合度最低,為0.4555,期望雜合度為0.6789。3個(gè)養(yǎng)殖群體刺參的多態(tài)信息含量(pic)分別為0.6828,0.6386和0.6691;其中g(shù)k群體刺參pic最大,為0.6828,ns1群體刺參次之,為0.6691,ns2群體刺參最小,為0.6386。3個(gè)養(yǎng)殖群體的近交系數(shù)fis值分別為0.3760、0.2698和0.3094,均大于0。fis值表示近交系數(shù),當(dāng)fis0表明群體雜合子過剩,當(dāng)fis0表明群體雜合子缺失,當(dāng)fis=1時(shí)表明群體觀測雜合子完全缺失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)刺參養(yǎng)殖群體均存在一定程度的雜合子缺失現(xiàn)象;13個(gè)位點(diǎn)中3個(gè)群體雜合子缺失位點(diǎn)數(shù)分別為:12,9和11個(gè)。三個(gè)刺參群體兩兩之間的遺傳分化指數(shù)介于0.0141~0.0593之間,其中g(shù)k和ns2群體之間的遺傳分化指數(shù)最小(0.0141),NS2和NS1之間的遺傳分化指數(shù)最大(0.0593),GK與NS1群體代之間遺傳分化指數(shù)為0.0432。三個(gè)刺參群體兩兩之間的Nm值介于3.9629~17.5212之間,其中NS2與GK群體之間基因流最大(17.5212),NS2與NS1群體之間基因流最小(3.9629),GK與NS1群體代之間基因流為5.539。3個(gè)刺參養(yǎng)殖群體間的遺傳距離為0.0628~0.3166,遺傳相似指數(shù)為0.7286~0.9391。其中NS2與GK群體之間的遺傳距離最近,為0.0628,遺傳相似指數(shù)最高為0.9391;NS2與NS1群體之間的遺傳距離最遠(yuǎn),為0.3166,遺傳相似指數(shù)最低,為0.7286。NS2與GK群體代遺傳距離最近,首先聚為一支,由于NS1群體與其它2個(gè)群體遺傳距離相對較遠(yuǎn),FNS1和GK群體個(gè)世代最后與NS1代聚為一支。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)布局

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本文編號：2768688