【摘要】：凡納濱對蝦(舊稱南美白對蝦,Litopenaeus vannamei)是一種廣鹽性的海水養(yǎng)殖品種,生長快、存活率高、抗逆性強,廣受水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的青睞,是全球三大養(yǎng)殖對蝦之一。隨著其養(yǎng)殖產(chǎn)量的逐年升高,加之不科學的管理方式,海水養(yǎng)殖環(huán)境越來越差。因此越來越多的人用淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦,但是低鹽度條件下凡納濱對蝦會出現(xiàn)一系列的應激反應,導致對蝦免疫力下降,阻礙生長等。為了解決這一難題,研究人員開展了大量有關低鹽度脅迫與凡納濱對蝦應激關系的研究,但是對內(nèi)分泌與鹽度應激的研究卻很有限。因此本文以凡納濱對蝦為研究對象,從轉(zhuǎn)錄組、mRNA和蛋白水平三方面入手來探討其腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)與鹽度的應激關系,以期為低鹽度脅迫對甲殼類及其他水生動物內(nèi)分泌影響的研究提供一定的參考。1.長期低鹽度脅迫下凡納濱對蝦眼柄的轉(zhuǎn)錄組學分析凡納濱對蝦眼柄中的X器官-竇腺復合體為機體內(nèi)分泌的控制中心,所以本章采用Illumina高通量測序技術(shù),分析了長期低鹽度(3psu)脅迫對凡納濱對蝦眼柄內(nèi)基因表達的影響(25psu為對照組),以探究凡納濱對蝦內(nèi)分泌與鹽度應激的關系。De novo RNA測序共篩選出6.17×10~7 reads,總長度為8.98×10~(10) bp。利用Trinity軟件對結(jié)果進行拼接、比對后,得到17,222條Unigene,總長度為1.88×10~7 bp。通過功能注釋及KEGG富集分析,得到差異表達基因的個數(shù)為479(fold change2,P value0.05),其中上調(diào)基因150個,下調(diào)基因329個。有10個與內(nèi)分泌調(diào)控相關的基因發(fā)生了顯著的變化,其中腎素-血管緊張素系統(tǒng)的變化最為顯著(P=0.016),此系統(tǒng)中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和氨肽酶N(AP-N)均出現(xiàn)顯著下調(diào)。隨后,隨機從顯著變化的基因中選擇20個進行實時熒光定量PCR驗證,結(jié)果進一步證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的正確性和可靠性(R=0.97)。本研究表明,凡納濱對蝦體內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)在適應長期鹽度脅迫過程中發(fā)揮了重要的作用,是凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)。本研究不僅能為探究凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)提供新的思路,也能為甲殼動物內(nèi)分泌系統(tǒng)的研究提供一定的參考。2.凡納濱對蝦腎素-血管緊張素系統(tǒng)中關鍵基因的克隆與分析血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、氨肽酶N(AP-N)、血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT_1R)和腎素受體(RR)在RAS通路中發(fā)揮很重要的作用,因此本研究對這四個基因進行了片段克隆及生物信息學分析。最終得到四個基因分別對應2326bp、3100bp、593bp、1116bp核苷酸序列。其中ACE的分子質(zhì)量為79kDa,等電點為6.0,脂肪族指數(shù)為77.65,有信號肽,有48個磷酸化位點,無跨膜結(jié)構(gòu)域,O-糖基化位點為5個,N-糖基化位點為4個。AP-N的分子質(zhì)量為104kDa,等電點為6.13,脂肪族指數(shù)為85.32,有信號肽,有102個磷酸化位點,無跨膜結(jié)構(gòu)域,O-糖基化位點為9個,N-糖基化位點為10個。AT_1R的分子質(zhì)量為19kDa,等電點為4.73,脂肪族指數(shù)為90.29,無信號肽,有19個磷酸化位點,有2個跨膜結(jié)構(gòu)域,O-糖基化位點為1個,N-糖基化位點為2個。RR的分子質(zhì)量為36kDa,等電點為4.95,脂肪族指數(shù)為97.18,有信號肽,有34個磷酸化位點,有1個跨膜結(jié)構(gòu)域,O-糖基化位點為3個,N-糖基化位點為4個。并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹,進行了同源性比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與凡納濱對蝦這四個基因同源性較高的物種都是與其分類階層離得較近的物種。3.鹽度應激下凡納濱對蝦腎素-血管緊張素系統(tǒng)中關鍵基因的mRNA表達得到ACE、AP-N、AT_1R和RR四個基因片段之后,選取眼柄、肝胰腺和肌肉組織,進一步做了實時熒光定量PCR實驗,分析其m RNA的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個基因在所測組織中均有表達。在長期低鹽度脅迫過程中,凡納濱對蝦眼柄中ACE和AP-N的表達量顯著低于正常鹽度組,而AT_1R和RR均無顯著性差異,與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致。其它差異基因在低鹽度脅迫下的表達都呈下降趨勢,表明低鹽度脅迫下凡納濱對蝦眼柄中的RAS水平受到抑制。在肝胰腺中,低鹽度下ACE的表達顯著下調(diào)。另外,在急性低鹽度脅迫過程中,分別檢測眼柄、肝胰腺和肌肉中ACE、AP-N、AT_1R和RR在0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h和96h的mRNA表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),眼柄中ACE和AP-N比AT_1R和RR敏感,最先出現(xiàn)表達差異。同時,ACE和AP-N可能處于一個動態(tài)的、間斷性的調(diào)節(jié)過程,以不斷適應這種低鹽度脅迫對機體造成的應激。四個基因在肝胰腺和肌肉中的響應均不如眼柄強烈。其中ACE的表達在96h內(nèi)均無差異,表明肝胰腺和肌肉中的ACE在適應低鹽度脅迫的過程中不發(fā)揮作用�？傊�,在凡納濱對蝦適應低鹽度脅迫過程中,ACE、AP-N、AT_1R和RR在不同組織中的表達變化有所差異。4.凡納濱對蝦血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗體的制備及其在鹽度應激下的表達研究通過克隆出來的ACE基因片段,對序列進行氨基酸分析、疏水性分析以及抗原性分析,確定最終合成抗體的氨基酸區(qū)域為463-643。隨后全基因合成目的基因片段,獲得PCR產(chǎn)物,并構(gòu)建到pET28a和pET32a載體中誘導目的蛋白表達,對得到的蛋白進行純化和定量,進而免疫新西蘭白兔,收集血清并進行純化,用酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)的方法鑒定其特異性和滴度,所得抗體效價達1:80000,特異性強,并利用該抗體通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測ACE在長期低鹽脅迫下凡納濱對蝦的眼柄和肝胰腺中的蛋白表達變化情況。結(jié)果表明,低鹽度脅迫下凡納濱對蝦肝胰腺中ACE蛋白的表達量著低于正常鹽度組。于是推測,低鹽度脅迫下眼柄中ACE蛋白的表達量也可能顯著低于正常鹽度組,具體的相關結(jié)果有待進一步研究。
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

華東師范大學碩士學位論文第一章 文獻綜述第一節(jié) 動物腎素-血管緊張素系統(tǒng)的研究進展一、腎素-血管緊張素系統(tǒng)的介紹腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)（如圖 1.1）是動物體內(nèi)的一個非常復雜的內(nèi)分泌系統(tǒng)，由一系列多肽和酶組成，包括腎素（Renin）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、血管緊張素原（AGT）、血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）及其受體等(冉海紅和張然,2011)，具有調(diào)節(jié)動物體內(nèi)水鹽平衡、滲透壓和血壓等作用(Ames, 2002)。

2.1 長期低鹽度脅迫下凡納濱對蝦眼柄中表達差異 Unigene 分布的火山圖 圖中橫坐標表示長期低鹽度脅迫下凡納濱對蝦眼柄中差異基因 Fold Changelog2 的值，縱坐標表示差異基因 P-value 取-log10 的值。圖中黑色豎線依次表-2 和 2 倍差異閾值；黑色橫線表示 P-value = 0.05 的閾值。

圖 2.2 長期低鹽度脅迫下凡納濱對蝦眼柄中表達差異 Unigene 分布的 MA 圖圖中橫坐標表示長期低鹽度脅迫下凡納濱對蝦眼柄中差異基因的表達強度；坐標表示 P-value 取-log10 的值。MA 圖表示凡納濱對蝦眼柄中差異基因在不鹽度下的表達差異趨勢不隨表達量大小的變化而變化。 表達差異 Unigene 的 GO 富集分析對表達差異 Unigene 做了 GO 富集分析，如圖 2.3，發(fā)現(xiàn)其主要富集ogicalProcess、Cellularcomponent、MolecularFuction 三大類生物過程三大類生物過程中富集顯著的 Unigene 主要集中在 proteinmaturatiocellular region 中。

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本文編號：2768250