發(fā)布時間：2020-07-23 21:24

【摘要】：厚殼貽貝Mytilus unguiculatus Valenciennes,1858是一種廣泛分布于西北太平洋溫帶海區(qū)沿岸的雙殼綱貝類。其物種特性和營養(yǎng)價值,使得厚殼貽貝在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類市場中占有重要地位。在國內(nèi),盡管厚殼貽貝已經(jīng)有較長的一段人工馴養(yǎng)歷史,人工育苗技術(shù)也相對完善,但是對于該物種的研究仍停留在營養(yǎng)價值、生理生化和病蟲害防治等方面。其遺傳特性雖有相關(guān)研究報道,但大多屬于地區(qū)性的小尺度空間研究,關(guān)注其主要棲息分布區(qū)的大尺度空間研究仍屬空白。本研究采用3種不同的分子遺傳學手段,對東海主產(chǎn)區(qū)(舟山ZS,象山XS,玉環(huán)YH,臺山TS,平潭PT,廈門XM)以及黃海區(qū)(青島QD)的厚殼貽貝進行系統(tǒng)地理學研究,主要研究結(jié)果如下:1.線粒體DNA分子標記分析利用2種線粒體DNA分子標記(COI基因和Cyt b基因)對上述7個厚殼貽貝樣本群體,共計195個厚殼貽貝個體,利用分子標記引物進行目的片段PCR擴增,對產(chǎn)物進行雙端測序獲取基因序列信息進行分析。結(jié)果顯示,各樣本的遺傳多樣性處于較高水平,具有較高的單倍型多樣性,但是遺傳結(jié)構(gòu)相對單一且薄弱,沒有明顯的遺傳分化現(xiàn)象。各單倍型在樣本內(nèi)的分散且均勻,單倍型網(wǎng)絡(luò)圖與樣本的地理分布情況不吻合。在基因選擇壓力檢測上,發(fā)現(xiàn)各樣本均受到了一定的負向選擇作用。從歷史動態(tài)分析上看,各樣本均未檢測到發(fā)生過顯著的群體事件,包括群體擴增或群體瓶頸。Bayesian skyline plot分析表明有效群體大小呈現(xiàn)一個穩(wěn)定發(fā)展的狀態(tài),各樣本的演化在近萬年內(nèi)相對穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)較大的群體波動,屬于穩(wěn)定的群體。綜上,可以推測在目前研究的7個樣本應(yīng)當屬于同一世族下。2.微衛(wèi)星DNA分子標記分析本研究中通過已發(fā)表的M.unguiculatus轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選合適的核心區(qū)設(shè)計微衛(wèi)星引物,共計120對。從120對引物中,篩選開發(fā)獲得具有高多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA標記引物,共計23對。之后,從23對引物中,篩選出10對最合適的引物作為7個樣本(共計350個厚殼貽貝個體)的微衛(wèi)星標記引物。擴增分型后,結(jié)果顯示,各樣本的遺傳多樣性處在中等水平,樣本大部分位點的遺傳近交系數(shù)(F_(IS))為顯著正值,說明樣本內(nèi)可能存在近交現(xiàn)象。遺傳結(jié)構(gòu)存在微弱的遺傳分化現(xiàn)象,處于黃海區(qū)的QD(青島)樣本與東海區(qū)的其他樣本存在微弱的分化現(xiàn)象。樣本未檢測到群體瓶頸事件或者群體擴增事件。綜上,7個樣本在受到近交影響下出現(xiàn)了遺傳多樣性降低,遺傳結(jié)構(gòu)減弱的現(xiàn)象。3.ⅡB-RAD測序技術(shù)分析通過簡化基因組測序的方式,采用群體基因組學方法,分析7個樣本的遺傳學規(guī)律。對70個厚殼貽貝個體進行簡化基因組測序后,利用無參方法構(gòu)建參考基因組分析測序數(shù)據(jù)。平均測序深度15×,獲得20G大小的基因組數(shù)據(jù),共計開發(fā)獲得13,009個新型SNP標記。利用13,009個SNP標記進行數(shù)據(jù)分析,各樣本的遺傳多樣性處于一個中等水平。大部分個體的基因組數(shù)據(jù)聚類在同一個區(qū)域內(nèi),遺傳分化現(xiàn)象不明顯,沒有出現(xiàn)和地理分布相吻合的情況。4.不同分子標記的結(jié)果差異性對于本研究中使用的3種分子標記,進行結(jié)果的對比和優(yōu)缺點的判斷,發(fā)現(xiàn)使用SNP分子標記,搭配合適的高通量測序技術(shù)可以獲得最為全面且準確的遺傳數(shù)據(jù),利用群體遺傳學和群體基因組學的分析手段和經(jīng)典理論,可以很好的對個體、樣本乃至樣本間的遺傳數(shù)據(jù)進行挖掘,從而判斷樣本的遺傳多樣性水平,獲取樣本間遺傳差異。厚殼貽貝的幼體浮游期持續(xù)時間為3到4周,產(chǎn)卵時間為冬季。較長的浮游期和在冬季的繁殖期,使得海區(qū)內(nèi)沿岸流對浮游幼體的擴散傳播起到了促進作用。且冬季沿岸各江河,特別是長江的沖淡水處在一個疲弱的狀態(tài),匯入海中的淡水流量下,流速慢,無法阻止浮游幼體的南北流動。這兩大因素造成了厚殼貽貝的幼體可以在海區(qū)內(nèi)隨洋流任意傳播,這也就導(dǎo)致了各地區(qū)間的基因流交換頻繁,進而降低了遺傳多樣性,削弱了遺傳結(jié)構(gòu)。而人工養(yǎng)殖環(huán)境與自然棲息環(huán)境混雜,使得養(yǎng)殖樣本有機會脫逃到自然樣本中的情況,也進一步削弱了自然樣本的遺傳完整性。加之養(yǎng)殖樣本的苗種來源大多屬于單一親本,近親繁殖現(xiàn)象較為突出,養(yǎng)殖樣本的脫逃也會導(dǎo)致自然樣本的遺傳多樣性的淡化。本研究旨在對厚殼貽貝的遺傳學特性進行一次較為全面的普查和資料積累,填補對該物種在群體遺傳研究方面的研究短板,充實關(guān)于該物種在群體遺傳研究的基礎(chǔ)資料。為今后選種育種、遺傳資源保護和養(yǎng)殖管理,提供理論支持和材料積累。
【學位授予單位】：浙江海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 3.1-1 樣本采集地圖Figure 3.1-1 The map of sampling3.1.1.2 樣本的保存與 DNA 提取樣本采集后，解剖取其閉殼肌，置于無水乙醇固定，放于-20°C 下保存。采用改良鹽析法[102]提取總 DNA，技術(shù)路線如表 3.1-2表 3.1-2 總 DNA 提取技術(shù)路線表Table 3.1-2 The method of DNAextraction步驟 具體操作1 剪取 10mg 閉殼肌組織，并用純水沖洗，吸干多余水分2 將剪取的組織置于干凈的 1.5ml 離心管中，加入 400μl 裂解液并將組織剪成絮狀3 加入 10μl 蛋白酶 K，并置于 55°C 水浴鍋中過夜消化

圖 3.1-2 PCR 反應(yīng)程序Figure 3.1-2 The flow of PCR3.1.3 數(shù)據(jù)分析對序列測序結(jié)果使用軟件 BioEdit（版本 7.25）[104]對測序峰圖文件進行分析，篩選峰型標準且無干擾的片段，使用軟件 Seqman（版本 8.1）[105]對篩選過的雙向序列進行拼接，使用程序 ClustalX（版本 2.0）[106]生成同一標記的所有樣本的測序序列 FASTA文件，將所有測序獲得的 M. unguiculatus 個體的 COI 序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中使用BLAST 工具（網(wǎng)址：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對，確認樣本的物種歸屬，剔除比對相似性低于 99%的個體。將剔除非 M. unguiculatus 后的各線粒體 DNA 基因的所有個體的序列文件保存為FASTA 格式，使用軟件 MEGA（版本 7.0）[107]進行序列比對并兩端切平。使用程序jModelTest（版本 2.0）[108]對序列進行堿基替代模型檢測，獲取最佳堿基替代模型。使用軟件 DnaSP（版本 6.0）[109]進行單倍型統(tǒng)計區(qū)分，統(tǒng)計各經(jīng)典遺傳參數(shù)，如單倍型

圖 3.2-1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 DNAFigure 3.2-1 Detected total DNAby agarose gel electrophoresis (1%)圖 3.2-2 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物（COI 部分）

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本文編號：2767859