【摘要】：花鰻鱺是降海洄游性魚類,具有很高的營養(yǎng)價值和市場開發(fā)前景,其幼鰻(鰻苗)須從海水遷移到淡水中生長發(fā)育。目前對花鰻鱺滲透壓調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答方面的探索,已經(jīng)從細(xì)胞形態(tài)和病理檢測水平轉(zhuǎn)移到了分子機制水平的研究。但關(guān)于激素受體基因在洄游性魚類鹽度適應(yīng)調(diào)節(jié)方面的研究和熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSP)在免疫應(yīng)答方面的報道還很少。精氨酸催產(chǎn)素受體(Arginine vasotocin receptors,AVTRs)和異亮氨酸催產(chǎn)素受體(Isotocin rexeptor,ITR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPCR),它們與配體結(jié)合之后,激活耦合的G蛋白,并啟動多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng),在滲透調(diào)節(jié)過程中扮演著重要角色。此外,HSP常作為分子伴侶識別多肽,抵御不利刺激,發(fā)揮細(xì)胞保護功能。本文以花鰻鱺幼鰻為研究材料,初步探究AVTRs,ITR在不同鹽度環(huán)境下的表達變化規(guī)律和HSP感染嗜水氣單胞菌后的表達變化模式。具體研究結(jié)果如下:1.花鰻鱺AVTRs和ITR基因的克隆、鑒定與表達分析采用RACE技術(shù),首次克隆了花鰻鱺AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因的cDNA全長,其中三者全長分別為3049 bp、2101 bp和2191 bp;分別包括1260 bp開放閱讀框(ORF)編碼419個氨基酸,1656 bp個ORF編碼551個氨基酸以及1131 bp個ORF編碼376個氨基酸;5'UTR區(qū)和3'UTR區(qū)分別為237bp和1552b、158bp和287 bp、69 bp和1060 bp; DNA star軟件預(yù)測它們的分子量分別為47.784 KD、59.884 KD和42.970 KD,等電點分別為8.664、8.705和9.292;氨基酸序列分析結(jié)果表明每個受體都含有G蛋白偶聯(lián)受體所特有的七次跨膜結(jié)構(gòu)域。通過多重比較和系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)花鰻鱺AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因在魚類中高度保守。運用熒光定量PCR技術(shù),檢測花鰻鱺AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因在腦、鰓、腸、肝臟、脾、腎臟、肌肉和心臟8種組織中廣泛分布,不同基因間有組織特異性。選取鹽度0、鹽度10(Brackish water, BW)和鹽度25(Seawater,SW)的花鰻鱺腦、鰓、腸三種組織進行分析,結(jié)果AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因的mRNA均發(fā)生顯著差異表達變化(P0.05)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),檢測腦組織中AVTRV1a2蛋白的表達量,結(jié)果表明它在BW組呈先升高后降低趨勢,SW組顯著下調(diào)。此外,在鰓組織中,探究了三個受體基因分別和三個離子基因NKAα1、CFTR和NHE8之間的相關(guān)性,結(jié)果表明三個受體基因和NKAα1、NHE8存在很強的相關(guān)性,與CFTR中度相關(guān)。2.花鰻鱺HSP90、HSP70和HSC70的鑒定與表達分析本研究首次克隆了花鰻鱺三個熱休克蛋白基因(AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70)的 cDNA 的全長,分別為 2527 bp、2443 bp 和 2247 bp; ORF 分別為 2181 bp、1932 bp和1950 bp,分別編碼726、643和649個氨基酸;預(yù)測分子大小分別為83.6、70.5 和 71.21 KD,理論等電點為 5.47、5.44 和 5.28; 5'UTR 和 3'UTR 分別為58 bp 和 288 bp、79 bp 和 432 bp、79 bp 和 218 bp。氨基酸序列顯示 AmHSP90 含有一個典型的組氨酸激酶(histidine kinase-like ATPase)結(jié)構(gòu)域,含有5個保守的HSP90蛋白家族信號,特征序列MEEVD位于AmHSP90的C末端,AmHSP70和AmHSC70都包含ATP/GTP結(jié)合位點A (ATP/GTP-binding site),一個雙邊核定位信號(KK和RRLRT)和HSP70家族的三個保守結(jié)構(gòu)域,經(jīng)典的細(xì)胞溶質(zhì)模體EEVD位于3'末端。通過多重比對和系統(tǒng)進化樹分析,結(jié)果表明三個熱休克蛋白基因高度保守。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了 AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70在八種組織中的分布情況,結(jié)果表明,三個熱休克蛋白在肝、腸、肌和心中表達量高于其它組織。通過注射生理鹽水和嗜水氣單胞菌單胞菌,AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70在嗜水氣單胞菌感染后其mRNA表達量均發(fā)生了顯著變化。結(jié)果表明,四個組織中的AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70在免疫應(yīng)答過程中扮演著重要角色,特別是肝組織對嗜水氣單胞菌有著更為敏感的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

ＡＶＴＲＶｌａ２在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用；ＡＶＴＲＶ２與所選物種的氨基酸序列相似性為逡逑３２．５７邋％一５３．４２邋％之間，一致性為邋６６．５０邋％，標(biāo)志三聯(lián)體邋Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ邋（ＤＲＨ）可使逡逑ＡＶＴＲＶ２在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用（圖２．５）；邋ＩＴＲ與所選物種的氨基酸序列相似性為逡逑５３．７６邋％—７５．８２邋％之間，一致性為邋７４＿４７邋％，標(biāo)志三聯(lián)體邋Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ邋（ＤＲＣ）可使邋ＩＴＲ逡逑在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用（圖２．６）。表明花鰻鱺三個激素受體蛋白在物種間高度保守，逡逑并且均有７個跨膜區(qū)，屬于Ｇ蛋白偶聯(lián)家族。逡逑：：：：：：邐泛悉；；疆；｜：邐＾逡逑ｗ邋：一：………‘媫！ｈ逡逑＝邋？我ｒｖｓｉｖｘｒｙ邋？＜ｆ邐－邋ＡＴ８＾３３？＂ＩＳＳ＾ＳＥ邋ｇｆＴｌ邋ｆｔ．Ｏ逡逑，．邐＇ｆｊｖｕ邐ｒｌＭ２邋＞ｖ邋龍１＂＇＊邋私．？邐ｖ？邋４．逡逑＿濯b\0二１１１翻＿W＿邋Ｉ逡逑■ｖＸｍｉ．ｖ．邋＇ｖｗｍｖ邋ｑｚｘ邋ｍｖＸＳ＊邐ｔｒｘｖｆ＾ｓＸｆＸ邋ｉｆｔ．Ｊｉ＊＊邐Ｋ邋ｘ：ｔ逡逑Ａｖｘ？ｖａ？ｚ邋．ｃｘ？邐“

本文編號：2764415