【摘要】：水溫能直接影響變溫動(dòng)物硬骨魚類的轉(zhuǎn)錄程序。然而,硬骨魚類響應(yīng)溫度系統(tǒng)的分子機(jī)制到目前為止還不為人知。我們使用RNA-seq的方法,對(duì)梯度低溫處理后的斑馬魚的8個(gè)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。處理溫度是從正常溫度(28℃)到中度低溫(18℃)再到極端的低溫(10℃)。對(duì)差異表達(dá)基因使用模糊k值聚類算法,結(jié)果表明這些基因被分類到34個(gè)不同表達(dá)模式的基因clusters中,這說(shuō)明斑馬魚對(duì)低溫的組織特異性響應(yīng)和普遍的交叉響應(yīng)之間存在一定的聯(lián)系。對(duì)這些基因參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)有31個(gè)GO term分類涉及到不同的細(xì)胞生理過(guò)程,例如RNA剪接和質(zhì)子運(yùn)輸;涉及到組織特異性進(jìn)程,例如在腎組織中的“肽鏈內(nèi)切酶的負(fù)調(diào)控”。表現(xiàn)出相似表達(dá)模式的基因很可能在轉(zhuǎn)錄水平上是受到共調(diào)控的。而這種共調(diào)控是通過(guò)順式作用元件和反式作用因子的程序性相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。我們通過(guò)對(duì)這些clusters涉及到的基因使用DREME算法,從聚類的基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域的1kb以內(nèi)的序列中,篩選富集的核苷酸序列-motifs。被找到的motifs的p值是根據(jù)超幾何分布計(jì)算的,各組中被找到的motifs的p值小于1x10-4,該motifs才能被視作是具有顯著性的。因此當(dāng)生物體受到低溫脅迫時(shí),這些motifs可能在其調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起到重要作用,即某個(gè)motif控制含有該motif的基因,使其具有相似的表達(dá)模式。使用TOMTOM工具把所有找到的motifs和JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)里的已知的motifs進(jìn)行比對(duì),總共發(fā)現(xiàn)了17個(gè)motifs。其中10個(gè)motifs的序列和JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)里的已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相同,因此,這些motifs被視作已知的motifs。尋找特異性motifs所涉及到的所有基因,在整個(gè)clusters中的百分比是不一樣的,最高的百分比達(dá)到了48%,這表明這個(gè)cluster中有接近一半的共表達(dá)基因受到這個(gè)motif調(diào)控。我們選取新發(fā)現(xiàn)的AGMAACCA motif和已知的AP-1 motif在細(xì)胞系中對(duì)其進(jìn)行低溫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它們確實(shí)在低溫壓力下控制基因表達(dá)。這些富集的motifs和轉(zhuǎn)錄因子會(huì)在很大程度上促進(jìn)優(yōu)化低溫響應(yīng)作用通路。除此之外,為研究南極魚ATP酶類在其低溫適應(yīng)下的作用,我們從鱗頭犬牙南極魚(Dissostichus mawsoni)的c DNA文庫(kù)中克隆了ATP6V0C基因,并轉(zhuǎn)染到He La細(xì)胞中,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞在低溫脅迫下(10℃)的死亡率。我們獲得了dm ATP6V0C基因的全部編碼序列,其長(zhǎng)度為462 bp,并將其插入到真核表達(dá)載體pc DNA3.1(-)上用于體外表達(dá)。冷脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比較,在低溫脅迫下,過(guò)表達(dá)dmatp6v0c基因的He La細(xì)胞的死亡率從19.23±1.87%降低到8.13±0.04%(P0.05)。這說(shuō)明在低溫脅迫下dm ATP6V0C基因過(guò)表達(dá)能顯著降低He La細(xì)胞的死亡率,為dm ATP6V0C基因作為魚類耐寒育種的候選基因提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 2.1 降溫策略和樣品采集示意圖tic diagram showing the cooling time course and th 10℃停留 12h 后，每個(gè)溫度點(diǎn)分別隨機(jī)魚分 8 個(gè)組織進(jìn)行解剖，相同的組織收集

RPKM）大于 2 且校準(zhǔn)過(guò)的 P-value 小于 0.001。差異表達(dá)基因在各組織中的分布情況(圖2.2)。圖 2.2 差異表達(dá)基因在各組織中的分布情況Figure 2.2 Venn diagrams showing the overlap of the genes with > 2-foldchanges among three comparisons18

還是和 18℃對(duì) 10℃組比較，28℃對(duì) 10℃組都是最少的（圖 2.2）。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是在 18℃對(duì) 10℃組中發(fā)現(xiàn)的大量差異表達(dá)基因的變化方向是相反的(圖 2.3)。簡(jiǎn)而言之，在幾乎所有組織中上調(diào)基因的數(shù)目和下調(diào)基因的數(shù)目幾乎相等（圖2.3）。圖 2.3 三種溫度比較中差異表達(dá)基因在組織中的分布及變化趨勢(shì)Figure 2.3 The tissue distribution and change trend of differentially expressed (DE) genesthat have a greater than 2-fold RPKM difference in three comparisons (28°C versus 18°C,18°C versus 10°C and 28°C versus 10°C)2.3.2 基因聚類分析區(qū)分基因的一般表達(dá)模式和組織特異性表達(dá)模式在多個(gè)組織中分析低溫壓力下的斑馬魚的轉(zhuǎn)錄組變化，為了將表現(xiàn)出相同調(diào)節(jié)趨勢(shì)的基因進(jìn)行歸類，我們用模糊 k 值聚類方法（fuzzy k-means clusteringmethod）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類。模糊 k 值聚類方法被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜的數(shù)據(jù)19

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡雪松;李池陶;徐偉;曹頂臣;賈智英;石連玉;;黑龍江鯉、德國(guó)鏡鯉選育系與荷包紅鯉抗寒品系生長(zhǎng)及越冬體重?fù)p失的初步研究[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2010年08期

本文編號(hào)：2761118