【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)和其他蟹類一樣,具有強(qiáng)大的斷肢再生能力,在肢體再生生物學(xué)研究上具特有優(yōu)勢(shì)。本文采用養(yǎng)殖生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等研究手段,在實(shí)驗(yàn)室及室外養(yǎng)殖條件下,對(duì)中華絨螯蟹斷肢仔蟹和成蟹進(jìn)行了生長(zhǎng)性能評(píng)估,并對(duì)肢體再生不同階段進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組研究,探討了中華絨螯蟹肢體再生的基因表達(dá)譜和分子機(jī)制,結(jié)果如下:一、斷肢再生對(duì)中華絨螯蟹仔蟹蛻殼、生長(zhǎng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響以中華絨螯V期仔蟹為材料,研究了人工壓力法切斷其4個(gè)步足(左側(cè)第1、3步足和右側(cè)第2、4步足)后的蛻殼、生長(zhǎng)與相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律。兩個(gè)蛻殼周期的分析發(fā)現(xiàn):斷肢蟹當(dāng)期蛻殼的步足再生率為7.6%,第二次蛻殼后的再生率為91.6%;斷肢蟹與正常蟹的成活率無顯著差異(P0.05);斷肢蟹在斷肢當(dāng)期的蛻殼周期要顯著長(zhǎng)于正常蟹(P0.01),但蛻殼后增重率顯著高于正常蟹(P0.05),而第二次的蛻殼周期要顯著短于正常蟹(P0.01),但蛻殼后增重率與正常蟹無顯著差異(p0.05);經(jīng)兩次蛻殼后,斷肢蟹與正常蟹在整體蛻殼周期上不存在顯著差異(p0.05)。相關(guān)基因表達(dá)差異分析表明:斷肢蟹與正常蟹在胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf2)、維甲類x受體(rxr)、蛻皮抑制激素(mih)三個(gè)基因的表達(dá)上無顯著差異(p0.05);但斷肢蟹的蛻皮激素受體(ecr)基因的表達(dá)量顯著高于正常蟹(p0.05),而肌肉生長(zhǎng)抑制素(mstn)基因的表達(dá)量卻顯著低于正常蟹(p0.05)。綜合表明:中華絨螯蟹仔蟹發(fā)生斷肢后,能在兩個(gè)蛻殼周期完成再生,且與正常蟹在成活率、蛻殼周期和蛻殼后增重率上無顯著差異;ecr和mstn基因?qū)Υ龠M(jìn)中華絨螯螯再生肢體的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用;斷肢仔蟹可在生產(chǎn)上繼續(xù)使用。二、二齡中華絨螯蟹斷肢再生的生長(zhǎng)性能評(píng)估和遺傳生理分析在室外水泥池條件下研究了不同斷肢數(shù)量(去兩步足、去三步足和未去步足)對(duì)中華絨螯蟹二齡成蟹養(yǎng)成階段生長(zhǎng)及生理的影響。自斷肢后三個(gè)蛻殼周期的研究發(fā)現(xiàn):斷肢對(duì)二齡蟹的生長(zhǎng)影響較大,表現(xiàn)在生長(zhǎng)上:三個(gè)蛻殼周期后,成活率顯著降低,去三步足(24.3%)去兩步足(41.0%)未去步足(50.8%)(p0.01);每次蛻殼后性狀均值(體重、殼長(zhǎng)、殼寬)顯著降低,去三步足去兩步足未去步足(p0.01);第三次蛻殼后去步足蟹(去兩步足和去三步足)的肥滿度顯著低于未去步足蟹(p0.05);第一次蛻殼后斷肢蟹性狀增長(zhǎng)率(體重、殼長(zhǎng)和殼寬)顯著低于正常蟹(p0.05),而第二、三次蛻殼后斷肢蟹又顯著高于正常蟹(p0.05)。表現(xiàn)在遺傳與生理上:血淋巴中的蛻皮激素含量在每次蛻殼后的組間無顯著差異(p0.05);肌肉抑制基因(mstn)在再生肢體中顯著低表達(dá)(p0.01);胰島素樣生長(zhǎng)因子2(igf-2)和蛻皮抑制激素基因(mih)在斷肢蟹和正常蟹中無表達(dá)差異(p0.05)。綜合研究表明:中華絨螯蟹二齡成蟹養(yǎng)殖階段發(fā)生的斷肢對(duì)生長(zhǎng)具有不利影響,雖然在肢體再生后斷肢蟹表現(xiàn)出一定程度的補(bǔ)償生長(zhǎng)效應(yīng),但其補(bǔ)償能力有限。生產(chǎn)上我們建議養(yǎng)殖戶挑選健壯且肢體完整的扣蟹進(jìn)行成蟹階段的養(yǎng)殖。三、中華絨螯蟹不同斷肢再生階段的比較轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)獲得了斷肢蟹與正常蟹在肢體再生的三個(gè)階段:傷口形成階段(斷肢后24小時(shí))、肢芽形成階段(斷肢后13天)、新肢發(fā)育階段(第二次蛻殼后0小時(shí))的眼柄和斷肢基部肌肉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。denovo拼接的河蟹轉(zhuǎn)錄組含有66333個(gè)轉(zhuǎn)錄本,其中30949個(gè)轉(zhuǎn)錄本能被ncbi-nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,26030個(gè)能被uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn),傷口形成階段共有583個(gè)差異表達(dá)基因,其中539個(gè)基因在斷肢蟹中高表達(dá),44個(gè)基因在正常蟹中高表達(dá);在肢芽形成階段共有2262個(gè)差異表達(dá)基因,其中1806個(gè)基因在斷肢蟹中高表達(dá),456個(gè)基因在正常蟹中高表達(dá);在新肢發(fā)育階段共有241個(gè)差異表達(dá)基因,其中167個(gè)基因在斷肢蟹中高表達(dá),74個(gè)基因在正常蟹中高表達(dá)。功能富集分析表明,斷肢再生不同階段肢體發(fā)育模式具有差異,傷口形成階段主要為免疫響應(yīng),肢芽形成階段主要為肢芽形態(tài)發(fā)生,新肢發(fā)育階段主要為新肢生長(zhǎng)。此外,Wnt和Notch通路在斷肢再生過程的激活體現(xiàn)了其在斷肢再生過程中的必要性。綜合研究表明:斷肢再生是是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,斷肢再生不同發(fā)育階段的基因表達(dá)模式體現(xiàn)了中華絨螯蟹的免疫響應(yīng)、肢芽形態(tài)發(fā)生以及新肢生長(zhǎng)的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文1 材料和方法1.1 試驗(yàn)材料與飼養(yǎng)管理取本實(shí)驗(yàn)室中華絨螯蟹配套選育系 A 的同一家系Ⅴ期仔蟹 160 只，隨機(jī)分為兩組：斷肢組（實(shí)驗(yàn)組）和正常組（對(duì)照組），每組雌雄各 40 只。斷肢前對(duì)仔蟹進(jìn)行體重、殼長(zhǎng)、殼寬等性狀測(cè)量，然后對(duì)斷肢組采用壓力法迫使其自切掉左側(cè)第 1、3 步足和右側(cè)第 2、4 步足，共 4 個(gè)步足（圖 1.1）。將斷肢組與對(duì)照組分別放養(yǎng)在40 個(gè)容積為 60L 的水簇箱中，每個(gè)水簇箱放養(yǎng) 4 只中華絨螯蟹（斷肢組和正常組雌、雄各 1 只）。水簇箱內(nèi)種植伊樂藻（Elodea nuttallii），每天早晚各投喂 1 次飼料，每 3 天換水 1 次，試驗(yàn)期間保持各個(gè)水簇箱的養(yǎng)殖環(huán)境基本一致。

圖 1 斷肢蟹和正常蟹的蛻殼周期差異Fig.1 Molt cycle difference between intact crabs and leg amputated crabsA 表示第一個(gè)“蛻殼周期”差異；B 表示第二個(gè)蛻殼周期差異；C 表示兩蛻殼周期平均差異Apresented the first inter-molting period; B presented the second inter-molting period; C presentedthe mean inter-molting period from the above two times2.3 基因表達(dá)差異相關(guān)基因的熒光定量 PCR 表達(dá)檢測(cè)（圖 2）發(fā)現(xiàn)：在斷肢蟹與正常蟹步足肌肉中的（再生步足與正常步足比較）胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF2）、維甲類 X 受體（RXR）和眼柄中的蛻皮抑制激素（MIH）基因的表達(dá)上無顯著差異（P>0.05）；而在斷肢蟹與正常蟹肌肉中的（再生步足和正常步足比較）蛻皮激素受體（EcR）表達(dá)量顯著高于正常蟹（P<0.05），而肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）的表達(dá)量卻顯著低于正常蟹（P<0.05）。此結(jié)果初步表明，斷肢具有促進(jìn)中華絨螯蟹蛻殼，促進(jìn)再生肢

圖 2 斷肢蟹和正常蟹的相關(guān)基因表達(dá)差異Fig.2 Gene expression difference between intact crabs and leg amputated crabs3 討論生長(zhǎng)與蛻殼是中華絨螯蟹的重要生物學(xué)特性，而斷肢再生以及再生肢體的生長(zhǎng)發(fā)育都離不開蛻殼。本文研究表明，中華絨螯蟹在斷肢后，能在兩次蛻殼后完成再生，再生肢體的外部形態(tài)接近正常肢體水平但能觀察到顯著大小差異，但也存在個(gè)別中華絨螯蟹在第一次蛻殼后肢體發(fā)生再生和第二次蛻殼后肢體也無法完成再生的情況。Yasuda 等研究發(fā)現(xiàn)，寄居蟹（Pagurus Middendorffii）的大螯能在一次蛻殼后完成再生[19]，Hopkins 對(duì)不同蛻殼時(shí)期的招潮蟹（Uca pugilator）進(jìn)行了肢體再生研究，發(fā)現(xiàn)肢芽生長(zhǎng)是在蛻殼間期，而不是蛻殼前期和后期進(jìn)行[14]，由此可知甲殼類動(dòng)物完成肢體再生需要的蛻殼周期是存在差異的。肢體再生所經(jīng)歷的蛻殼周期，一方面可能由斷掉肢體的生理功能的重要性決定，另一方面還和中華絨螯蟹本身所處于的蛻殼時(shí)期有關(guān)。本研究中，選取的為蛻殼前期的中華絨螯蟹，斷肢

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本文編號(hào)：2761480