【摘要】：在中國南方,羅非魚是主要的淡水養(yǎng)殖品種。近年來,由無乳鏈球菌引起的鏈球菌病在一定程度上制約了羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。無乳鏈球菌自身具有一定抗藥性,安全有效的抗生素尚未被開發(fā),疫苗的研發(fā)成為預(yù)控?zé)o乳鏈球菌病的有效方法。在現(xiàn)今,研究無乳鏈球菌菌株有高效交叉保護(hù)性的亞單位疫苗越來越受到重視。本研究是基于國內(nèi)外對無乳鏈球菌病有高保護(hù)性的無乳鏈球菌外表面蛋白的研究,克隆并表達(dá)了α-enolase,phosphoglycerate kinase(PGK)和Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)三種蛋白。將三種蛋白制備成疫苗免疫羅非魚,觀察對無乳鏈球菌病的保護(hù)效果。主要結(jié)果如下:1、經(jīng)BLAST同源比對和PCR技術(shù),得到α-enolase、PGK和GAPDH三種蛋白基因的ORF全長。α-enolase,全長1308 bp,編碼435個(gè)氨基酸(amino acid,aa),相對分子量為49.4kDa;PGK,全長1046 bp,編碼349 aa,相對分子量為42kDa;GAPDH,全長1011 bp,編碼336 aa,41.4kDa。經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測,三種蛋白均無信號肽,α-enolase可能存在跨膜結(jié)構(gòu)域。2、運(yùn)用原核表達(dá)和親和層析技術(shù),純化獲得α-enolase、PGK、GAPDH重組蛋白。三種重組蛋白均為可溶性表達(dá)。分別大量純化三種重組蛋白,超濾濃縮后保存并用于后續(xù)試驗(yàn)。3、制備疫苗,并進(jìn)行免疫效果評價(jià)。免疫羅非魚,第二周加強(qiáng)免疫后,進(jìn)行無乳鏈球菌THN(海南株)攻毒實(shí)驗(yàn)。三種蛋白制備的亞單位疫苗分別得到31.70%,28.70%和48.12%的相對保護(hù)率。將α-enolase,PGK和GAPDH重組蛋白分別與滅活全菌混合后制得疫苗,在加強(qiáng)免疫后第二周進(jìn)行無乳鏈球菌THN(海南株)攻毒,分別得到86.23%,68.67%和71.35%的相對保護(hù)率。運(yùn)用ELISA實(shí)驗(yàn)對免疫后的魚血清中的抗體滴度進(jìn)行了檢測,分析結(jié)果顯示抗體滴度顯著提高。本研究結(jié)果顯示無乳鏈球菌α-enolase,PGK和GAPDH蛋白具有一定的免疫原性,可作為羅非魚鏈球菌亞單位疫苗的候選基因或提高全菌滅活疫苗免疫保護(hù)效果的添加物。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;S943
【圖文】：

圖 2-1 pMD-19T 的圖譜和序列Fig. 2-1 The map and sequence of pMD-19T vector2. 1. 3 藥品及試劑1. 日本 Takara 公司: 限制性快速內(nèi)切酶 Quick cut BamHI 、Quick cut HindIII、Quick cut EcoRI、Quick cut XhoI 和 Quick cut NdeI；rTaq polymerase premix、ExTaqpolymerase、DL2,000 DNA ladder Marker；2. 北京普博欣公司：蛋白胨，酵母提取液，氨芐霉素，卡那霉素；3. 中國碧云天公司：Super-competent Cell Preparation Kit 細(xì)菌超級感受態(tài)制備試劑盒；4. Omega 公司：E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒，Plasmid MidiKit 質(zhì)粒提取試劑盒；2. 1. 4 試劑及培養(yǎng)基的配制

2-2 無乳鏈球菌 DNA 提取traction of Streptococcus agala 為 DL2,000 marker； 1-4：APDH 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)N 菌株DNA 為模板，以置 (圖 2-3)。

圖 2-2 無乳鏈球菌 DNA 提取Fig. 2-2 Extraction of Streptococcus agalactiae DNA注：M 為 DL2,000 marker； 1-4：DNA. 2 α-enolase，PGK 和 GAPDH 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果以提取的無乳鏈球菌THN 菌株DNA 為模板，以設(shè)計(jì)的特異性引物來擴(kuò)R 產(chǎn)物條帶大小在預(yù)期位置 (圖 2-3)。

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本文編號：2760185