發(fā)布時間：2020-07-16 09:28

【摘要】：中華鱉(Pelodiscus sinensis)屬于爬蟲綱龜鱉目,是古老的次水生爬行動物,作為變溫羊膜腔動物,是變溫無羊膜動物到恒溫羊膜腔動物進化的聯(lián)接點,對于系統(tǒng)發(fā)育學的研究有較高的科研價值。同時,中華鱉作為一種高營養(yǎng),高經(jīng)濟附加值的水產(chǎn)品,在東南亞地區(qū)、特別是中國,其養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大,疫病也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。由于對中華鱉及其病原學的基礎(chǔ)研究相對滯后,疫病防控的措施也相對缺乏,在中華鱉養(yǎng)殖中也曾出現(xiàn)了抗生素和違禁藥物濫用亂用等現(xiàn)象,導致藥物殘留等安全問題。本研究通過對IL-1β與TLR4基因的克隆研究,旨在探明它們與其他脊椎動物之間的差異,為中華鱉疾病防控,生理狀態(tài)監(jiān)控等提供研究基礎(chǔ)和依據(jù)。同時探討了枯草芽孢桿菌對于中華鱉免疫相關(guān)基因、腸道菌群以及生產(chǎn)性能的影響。1.中華鱉IL-1β的基因克隆,功能鑒定以及成熟肽切割位點的確定克隆和鑒別了中華鱉IL-1β分子(tIL-1)。序列分析結(jié)果表明,tIL-1β的cNDA全長1529 bp,包含一個61 bp的5'UTR,831 bp,編碼277個氨基酸的ORF和637bp的3'UTR, tIL-1βmRNA的3’UTR的GC含量高于已知的IL-1β。tIL-1β含有IL-1家族特征序列,結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,tIL-1β的C端為一個由12個β折疊組成IL-1特征結(jié)構(gòu)—β三葉草(p-trefoil)結(jié)構(gòu)；同源性分析表明,tIL-1β與來自鳥類的IL-1β最為接近,核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為為46.7%和58.4%。中華鱉人工感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后,tIL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在不同組織內(nèi)均有上升,脾臟中表達量最高,在感染后6h提高20倍。通過在HEK293細胞中共表達tIL-1β和 tcaspase-1,缺少經(jīng)典的哺乳動物特有的ICE (Interleukin-1β cut enzyme)位點的tIL-1β能夠被tcaspase-1切割。對可能切割的天冬氨酸位點進行突變,確認D130為tIL-1β的ICE位點。通過桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的tIL-1p成熟肽刺激中華鱉外周血單核／巨噬細胞(PBMo)可提高tIL-1β、COX-2等炎癥相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,說明tIL-1β具有類似哺乳動物的生物學功能。2.中華鱉Toll樣受體4的克隆和功能鑒定TLR4是Toll樣受體家族成員之一,能夠識別革蘭氏陰性菌細胞壁上的脂多糖成分(Lipopolysaccharide, LPS),并通過MyD88依賴和MyD88非依賴信號通路,誘導炎癥相關(guān)蛋白和干擾素的產(chǎn)生。研究克隆并鑒定了來自中華鱉的TLR4分子(tTLR4)的cDNA全長序列,tTLR4全長3396bp,ORF長為2502bp,編碼一個833個氨基酸的蛋白。在蛋白質(zhì)組成結(jié)構(gòu)上,由3個部分組成,分別為亮氨酸重復序歹(Leucine-rich repeat, LRR)和亮氨酸重復序列C端(LRRCT)組成的胞外區(qū)域,I型跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)的TIR (Toll-IL-1 receptor domain)結(jié)構(gòu)域。通過與其他脊椎動物TLR4基因的氨基酸和核苷酸序列相似度比較,以及基因組的鄰近基因組成分析顯示,tTLR4與哺乳動物,禽類的TLR4較為接近。嗜水氣單胞菌感染后中華鱉的血液和脾臟中的tTLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。PBMo經(jīng)100ng/ml的LPS刺激后,細胞中IL-1β,COX-2,以及tTLR4基因的mRNA水平顯著上升。構(gòu)建的穩(wěn)定表達tTLR4的HEK293細胞經(jīng)不同濃度的LPS刺激后,通過雙熒光素酶實驗檢測發(fā)現(xiàn),tTLR4可激活NF-κB啟動子,但不能激活I(lǐng)FN-β啟動子。研究結(jié)果顯示,tTLR4是哺乳動物和禽類TLR4的直系同源基因,具有與哺乳動物類似的生物學功能,并能通過MyD88-依賴途徑啟動中華鱉機體的免疫反應(yīng)。3.枯草芽孢桿菌對中華鱉腸道菌群,消化酶活以及免疫相關(guān)基因的影響研究了本實驗室篩選得到的一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對中華鱉生產(chǎn)性能,腸道微生態(tài)以及部分免疫相關(guān)基因的表達影響。中華鱉作為非模式動物,缺少各類模式相關(guān)(pattern recognition receptor, PRR)受體序列信息,借助于外周血轉(zhuǎn)錄組的De novo拼接得到的轉(zhuǎn)錄本,獲得了12條Toll樣受體基因(TLR)。飼養(yǎng)實驗結(jié)果表明,飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠顯著提高中華鱉體重,降低飼料轉(zhuǎn)化率,提高腸道內(nèi)的消化酶酶活。利用454測序?qū)δc道菌群進行分析表明,中華鱉腸道的中厚壁菌門為主要優(yōu)勢菌群,而枯草芽孢桿菌處理后,厚壁菌的比例進一步增加,并且擬桿菌,變形門菌等革蘭氏陰性菌幾乎消失。利用熒光定量對腸道免疫基因進行檢測發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌降低炎癥相關(guān)基因以及部分Toll樣受體的表達。利用體外的外周血單核/巨噬細胞(PBMo)模型發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對于炎癥基因的激活能力低于嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila),并且對嗜水氣單胞菌引起的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。以上結(jié)果表明,日糧中添加枯草芽孢桿菌能夠調(diào)整中華鱉腸道菌群結(jié)構(gòu),降低炎癥基因的表達,緩解腸道應(yīng)激,促進其生長。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S947.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 沈文英;李衛(wèi)芬;梁權(quán);鄧斌;陳南南;周緒霞;;飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚生長性能、免疫和抗氧化功能的影響[J];動物營養(yǎng)學報;2011年05期

2 高侃;汪海峰;章文明;劉建新;;益生菌調(diào)節(jié)腸道上皮屏障功能及作用機制[J];動物營養(yǎng)學報;2013年09期

3 桂琳;王曉清;康銀;曾丹;蔣迪;廖學敏;;復合益生菌對中華鱉生長及血液生化指標的影響[J];水生態(tài)學雜志;2015年02期

本文編號：2757827