【摘要】：凡納濱對蝦(Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei),又名南美白對蝦,自然分布于南美洲太平洋沿岸水域,是世界重要的對蝦類養(yǎng)殖品種之一。凡納濱對蝦具有適應性廣泛、對不良環(huán)境抗逆性強、生長速度快等特點,其肉質(zhì)鮮美,深受人們的喜愛,有著十分廣闊的市場前景。但是近年來由于氣候異常,導致我國南方凡納濱對蝦主養(yǎng)殖區(qū)屢次遭遇寒災,對凡納濱對蝦產(chǎn)業(yè)造成重大損失。異常低溫不僅導致凡納濱對蝦大量死亡,同時溫度因素也制約著凡納濱對蝦的養(yǎng)殖季節(jié)和地域,影響?zhàn)B殖產(chǎn)量和效益。為了加速培育出耐低溫凡納濱對蝦新品種,提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟效益,對凡納濱對蝦耐低溫相關性狀的遺傳參數(shù)進行估計是十分必要的。然而,在傳統(tǒng)的BLUP遺傳育種方法中,個體間親緣關系的確定來源于人為記錄的物理系譜,物理系譜的構建很容易由于標記脫落、誤讀和引入共同環(huán)境效應而導致信息錯誤或不準確,給性狀遺傳參數(shù)的準確估計造成困難。本研究首次將微衛(wèi)星分子標記引入凡納濱對蝦耐低溫性狀遺傳參數(shù)的評估中,通過計算分子親緣相關度構建分子系譜進而對性狀遺傳參數(shù)進行估計,并利用交叉驗證跟物理系譜相比較,以佐證分子親緣相關度在實際中估計性狀遺傳參數(shù)的可行性。本實驗主要結(jié)果如下:(1)本實驗通過篩選凡納濱對蝦多態(tài)性微衛(wèi)星位點,并不斷優(yōu)化位點組合、反應體系及反應程序,成功建立了一個五重、兩個四重和一個三重PCR反應體系,并將其應用于11個凡納濱對蝦家系的親權鑒定。結(jié)果顯示,4組多重PCR體系中的16個微衛(wèi)星位點在11個凡納濱對蝦家系中的平均等位基因數(shù)(Na)為6,平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.581,平均觀測雜合度(Ho)為0.513,平均期望雜合度(He)為0.636。利用Cervus3.0軟件,對已知系譜關系的11個凡納濱對蝦家系進行親權分析,其第一親本累積排除率(CE-1P)、第二親本累積排除率(CE-2P)和雙親累積排除率(CE-PP)分別為 0.99525487、0.99990862 和 0.99999986。進一步分析表明,當同時使用4組多重PCR體系進行親權分析時,其模擬配對率和親權鑒定準確率均為100%,全同胞和半同胞家系鑒別效果良好,體現(xiàn)出4組多重PCR體系具有良好的鑒別能力。(2)本實驗采用已經(jīng)建立的4組多重PCR體系對凡納濱對蝦家系進行基因分型,通過Coancestry 1.0.1.2軟件中TrioML參數(shù)計算個體間分子親緣相關度,進而構建分子系譜,并分別利用物理系譜和分子系譜對低溫條件下凡納濱對蝦生長及出肉率性狀進行遺傳參數(shù)估計。結(jié)果顯示,個體間分子親緣相關度均在0～1之間,平均值為0.058,分子親緣相關度與物理親緣相關度間皮爾遜相關系數(shù)為0.574,為中等強度正相關,表現(xiàn)出分子親緣相關度構建的分子系譜有較高的可信度。利用物理系譜估算出的體重(BW)、體長(BL)、肉重(MW)和出肉率(MR)性狀的遺傳力分別為 0.16±0.05、0.12±0.04、0.20±0.05 和 0.18±0.05,根據(jù)分子系譜估算上述性狀的遺傳力分別為0.07±0.03(BW)、0.04±0.02(BL)、0.10±0.03(MW)、0.10±0.03(MR),兩者皆為低水平遺傳力。在物理系譜信息下,計算得到低溫條件下凡納濱對蝦出肉率性狀與可測量性狀之間的遺傳相關,結(jié)果顯示出肉率(MR)與腹節(jié)全長(ASL)的遺傳相關系數(shù)為最大(0.636±0.133),低溫條件下凡納濱對蝦群體平均出肉率為51.37%。交叉驗證的結(jié)果表明,利用物理系譜和分子系譜計算的育種值預測值與觀察值間皮爾遜相關系數(shù)分別為0.56和0.55,兩者較為接近,說明利用分子系譜和物理系譜預測育種值的準確度相似總體來看,微衛(wèi)星分子標記應用在水產(chǎn)動物性狀遺傳參數(shù)估計中是具有巨大潛力的。本研究所得數(shù)據(jù)為制定科學有效的育種方案提供了參考,對進一步研究凡納濱對蝦耐低溫選育有積極的借鑒意義。
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖２－１凡納濱對蝦基因組ＤＮＡ逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｇｅｎｏｍｅｓ邋ＤＮＡ邋ｏｆ邋Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ邋ｖａｎｎａｍｅｉ逡逑．邋４．邋３凡納濱對蝦微衛(wèi)星引物的篩選及多重ＰＣＲ體系的優(yōu)化逡逑本實驗引用邋Ｍｅｅｈａｎ邋ｅｆ邋ａ／［１４４］、Ｚｈａｎｇ邋ｅｆ邋ａ／［１４５］、Ａ丨ｅｉｖａｒ－Ｗａｒｒｅｎ邋ｅｆ邋ａ／［５７］、Ｄｅｎｉｓｅ逡逑．ＧＡＲＣ丨Ａｄｆｌ／［１４６］和于洋等［１４７］文章中公布的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)，通過用非變性聚丙烯逡逑酰氨凝膠電泳（ＰＡＧＥ）來篩選在實驗群體中顯多態(tài)性的微衛(wèi)星位點。根據(jù)每個逡逑衛(wèi)星位點擴增片段長度的差異性和退火溫度進行多重ＰＣＲ位點組合，同時利逡逑ＭＰＥｐｒｉｍｅｒｓ軟件１｜４８，１４９］檢測篩選好的多重ＰＣＲ組合反應體系中的引物是否會逡逑生錯配、引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構，去除或替換影響整個體系穩(wěn)定性的引物對。逡逑過優(yōu)化多重ＰＣＲ反應體系中各引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)、以及反應體逡逑中各組分的濃度來達到多重ＰＣＲ體系的最佳擴增效果。逡逑．邋４邋４熒光標記修飾及基因分型逡逑本實驗采用四種不同的熒光標記來修飾引物，分別是６－ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、逡逑ＡＭＲＡ，保持每個多重ＰＣＲ組合中擴增片段大小相鄰的位點引物修飾的熒光種逡逑類不同。用ＡＢＩ邋３１３０ｘ１測序儀對ＰＣＲ產(chǎn)物進行基因分型，具體步驟為：①將ＰＣＲ逡逑

邐第二章凡納濱對蝦微衛(wèi)星多重ＰＣＲ體系的建立及其在家系親權鑒定中的應用邐逡逑三重邋ＰＣＲ邐ＤＮＡ邋模板（５０ｎｇ／ｎｌ）邐２＾ｉｌ邐９４°Ｃ邋５ｍｉｎ逡逑ｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋３邋ｌｏｃｉ邐ｌＯ＾Ｔａｑ邋Ｂｕｆｆｅｒ邐２．５（ｉｌ邐９４邋Ｃ邋４０ｓ邐、逡逑Ｍｇ＾（２５ｍＭｅａｃｈ）邐２．５＾１邐６２＂Ｃ（每循環(huán)降邋０．５。0邋ｌｍｉｎ邋＾０ｒ逡逑７２邋°Ｃ邋ｌｍｉｎ逡逑ｄＮＴＰ（２ｍＭ邋ｅａｃｈ）邐２．５ｕｌ邐＾逡逑９４邋°Ｃ邐４０ｓ邐＂逡逑Ｐｒｉｍｅｒ（ｌＯｕＭｅａｃｈ）邋ＴＵＭＸＬｖ８．２５６邐０．２ｕｌ逡逑５８邋Ｃ邋１邋ｍｉｎ邐ｙ邋１５ｒ逡逑ＴＵＭＸＬｖ８．２２０邐０．２５＾１邐７２°Ｃ邐ｌｍｉｎ逡逑ＴＵＭＸＬｖ７．５６邐０．３＾１邐９４邋＂Ｃ邐４０ｓ邐＂逡逑}0酶（２．５Ｕ／ｆｉｌ）邐０．３＾１邐５５＃Ｃ邋ｌｍｉｎ邐＞邋１５ｒ逡逑ｄｄＨ２０邐１３．７＾１邐７２°Ｃ邐ｌｍｉｎ邐＞逡逑７２邋°Ｃ邐５ｍｉｎ逡逑４0Ｃ邋Ｈｏｌｄ逡逑基因分型結(jié)果顯示，４組凡納濱對蝦微衛(wèi)星多重ＰＣＲ反應體系均可以獲得逡逑較好的擴增效果。其中，五重ＰＣＲ、四重ＰＣＲ１和四重ＰＣＲ２的基因分型峰值圖逡逑分別見圖２－２、圖２－３和圖２－４。１１個凡納濱對蝦家系在１６個微衛(wèi)星位點上的基逡逑因型信息見附表１。逡逑８０邐１６０邐２４０邐３２０邐４００邐４８０逡逑２４０００＋邐＊邐１邐＂Ｉ邐邐邋邐邐邐邐邐邐邐邐邐逡逑

］逡逑在親本總數(shù)為２０個，置信度為９５％的情況下，實驗驗證了邋４組微衛(wèi)星多重逡逑ＰＣＲ體系親權鑒定的準確率。如圖２－５所示，隨著不斷累加多重ＰＣＲ體系，其逡逑親權鑒定準確率逐漸提高，當同時使用４組多重ＰＣＲ體系進行親權分析時，無逡逑論親本性別是否已知，其親權鑒定準確率均為１００％。半同胞和全同胞家系均鑒逡逑別效果良好，驗證結(jié)果與模擬結(jié)果基本吻合，說明親權分析的結(jié)果具有較高的準逡逑確度和可信度。逡逑２６逡逑

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