【摘要】：凡納濱對(duì)蝦(Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei),又名南美白對(duì)蝦,自然分布于南美洲太平洋沿岸水域,是世界重要的對(duì)蝦類(lèi)養(yǎng)殖品種之一。凡納濱對(duì)蝦具有適應(yīng)性廣泛、對(duì)不良環(huán)境抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn),其肉質(zhì)鮮美,深受人們的喜愛(ài),有著十分廣闊的市場(chǎng)前景。但是近年來(lái)由于氣候異常,導(dǎo)致我國(guó)南方凡納濱對(duì)蝦主養(yǎng)殖區(qū)屢次遭遇寒災(zāi),對(duì)凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)造成重大損失。異常低溫不僅導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦大量死亡,同時(shí)溫度因素也制約著凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖季節(jié)和地域,影響?zhàn)B殖產(chǎn)量和效益。為了加速培育出耐低溫凡納濱對(duì)蝦新品種,提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益,對(duì)凡納濱對(duì)蝦耐低溫相關(guān)性狀的遺傳參數(shù)進(jìn)行估計(jì)是十分必要的。然而,在傳統(tǒng)的BLUP遺傳育種方法中,個(gè)體間親緣關(guān)系的確定來(lái)源于人為記錄的物理系譜,物理系譜的構(gòu)建很容易由于標(biāo)記脫落、誤讀和引入共同環(huán)境效應(yīng)而導(dǎo)致信息錯(cuò)誤或不準(zhǔn)確,給性狀遺傳參數(shù)的準(zhǔn)確估計(jì)造成困難。本研究首次將微衛(wèi)星分子標(biāo)記引入凡納濱對(duì)蝦耐低溫性狀遺傳參數(shù)的評(píng)估中,通過(guò)計(jì)算分子親緣相關(guān)度構(gòu)建分子系譜進(jìn)而對(duì)性狀遺傳參數(shù)進(jìn)行估計(jì),并利用交叉驗(yàn)證跟物理系譜相比較,以佐證分子親緣相關(guān)度在實(shí)際中估計(jì)性狀遺傳參數(shù)的可行性。本實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下:(1)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選凡納濱對(duì)蝦多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn),并不斷優(yōu)化位點(diǎn)組合、反應(yīng)體系及反應(yīng)程序,成功建立了一個(gè)五重、兩個(gè)四重和一個(gè)三重PCR反應(yīng)體系,并將其應(yīng)用于11個(gè)凡納濱對(duì)蝦家系的親權(quán)鑒定。結(jié)果顯示,4組多重PCR體系中的16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在11個(gè)凡納濱對(duì)蝦家系中的平均等位基因數(shù)(Na)為6,平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.581,平均觀(guān)測(cè)雜合度(Ho)為0.513,平均期望雜合度(He)為0.636。利用Cervus3.0軟件,對(duì)已知系譜關(guān)系的11個(gè)凡納濱對(duì)蝦家系進(jìn)行親權(quán)分析,其第一親本累積排除率(CE-1P)、第二親本累積排除率(CE-2P)和雙親累積排除率(CE-PP)分別為 0.99525487、0.99990862 和 0.99999986。進(jìn)一步分析表明,當(dāng)同時(shí)使用4組多重PCR體系進(jìn)行親權(quán)分析時(shí),其模擬配對(duì)率和親權(quán)鑒定準(zhǔn)確率均為100%,全同胞和半同胞家系鑒別效果良好,體現(xiàn)出4組多重PCR體系具有良好的鑒別能力。(2)本實(shí)驗(yàn)采用已經(jīng)建立的4組多重PCR體系對(duì)凡納濱對(duì)蝦家系進(jìn)行基因分型,通過(guò)Coancestry 1.0.1.2軟件中TrioML參數(shù)計(jì)算個(gè)體間分子親緣相關(guān)度,進(jìn)而構(gòu)建分子系譜,并分別利用物理系譜和分子系譜對(duì)低溫條件下凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及出肉率性狀進(jìn)行遺傳參數(shù)估計(jì)。結(jié)果顯示,個(gè)體間分子親緣相關(guān)度均在0～1之間,平均值為0.058,分子親緣相關(guān)度與物理親緣相關(guān)度間皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.574,為中等強(qiáng)度正相關(guān),表現(xiàn)出分子親緣相關(guān)度構(gòu)建的分子系譜有較高的可信度。利用物理系譜估算出的體重(BW)、體長(zhǎng)(BL)、肉重(MW)和出肉率(MR)性狀的遺傳力分別為 0.16±0.05、0.12±0.04、0.20±0.05 和 0.18±0.05,根據(jù)分子系譜估算上述性狀的遺傳力分別為0.07±0.03(BW)、0.04±0.02(BL)、0.10±0.03(MW)、0.10±0.03(MR),兩者皆為低水平遺傳力。在物理系譜信息下,計(jì)算得到低溫條件下凡納濱對(duì)蝦出肉率性狀與可測(cè)量性狀之間的遺傳相關(guān),結(jié)果顯示出肉率(MR)與腹節(jié)全長(zhǎng)(ASL)的遺傳相關(guān)系數(shù)為最大(0.636±0.133),低溫條件下凡納濱對(duì)蝦群體平均出肉率為51.37%。交叉驗(yàn)證的結(jié)果表明,利用物理系譜和分子系譜計(jì)算的育種值預(yù)測(cè)值與觀(guān)察值間皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為0.56和0.55,兩者較為接近,說(shuō)明利用分子系譜和物理系譜預(yù)測(cè)育種值的準(zhǔn)確度相似總體來(lái)看,微衛(wèi)星分子標(biāo)記應(yīng)用在水產(chǎn)動(dòng)物性狀遺傳參數(shù)估計(jì)中是具有巨大潛力的。本研究所得數(shù)據(jù)為制定科學(xué)有效的育種方案提供了參考,對(duì)進(jìn)一步研究凡納濱對(duì)蝦耐低溫選育有積極的借鑒意義。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖２－１凡納濱對(duì)蝦基因組ＤＮＡ逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｇｅｎｏｍｅｓ邋ＤＮＡ邋ｏｆ邋Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ邋ｖａｎｎａｍｅｉ逡逑．邋４．邋３凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星引物的篩選及多重ＰＣＲ體系的優(yōu)化逡逑本實(shí)驗(yàn)引用邋Ｍｅｅｈａｎ邋ｅｆ邋ａ／［１４４］、Ｚｈａｎｇ邋ｅｆ邋ａ／［１４５］、Ａ丨ｅｉｖａｒ－Ｗａｒｒｅｎ邋ｅｆ邋ａ／［５７］、Ｄｅｎｉｓｅ逡逑．ＧＡＲＣ丨Ａｄｆｌ／［１４６］和于洋等［１４７］文章中公布的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)，通過(guò)用非變性聚丙烯逡逑酰氨凝膠電泳（ＰＡＧＥ）來(lái)篩選在實(shí)驗(yàn)群體中顯多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。根據(jù)每個(gè)逡逑衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的差異性和退火溫度進(jìn)行多重ＰＣＲ位點(diǎn)組合，同時(shí)利逡逑ＭＰＥｐｒｉｍｅｒｓ軟件１｜４８，１４９］檢測(cè)篩選好的多重ＰＣＲ組合反應(yīng)體系中的引物是否會(huì)逡逑生錯(cuò)配、引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，去除或替換影響整個(gè)體系穩(wěn)定性的引物對(duì)。逡逑過(guò)優(yōu)化多重ＰＣＲ反應(yīng)體系中各引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)、以及反應(yīng)體逡逑中各組分的濃度來(lái)達(dá)到多重ＰＣＲ體系的最佳擴(kuò)增效果。逡逑．邋４邋４熒光標(biāo)記修飾及基因分型逡逑本實(shí)驗(yàn)采用四種不同的熒光標(biāo)記來(lái)修飾引物，分別是６－ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、逡逑ＡＭＲＡ，保持每個(gè)多重ＰＣＲ組合中擴(kuò)增片段大小相鄰的位點(diǎn)引物修飾的熒光種逡逑類(lèi)不同。用ＡＢＩ邋３１３０ｘ１測(cè)序儀對(duì)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行基因分型，具體步驟為：①將ＰＣＲ逡逑

邐第二章凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星多重ＰＣＲ體系的建立及其在家系親權(quán)鑒定中的應(yīng)用邐逡逑三重邋ＰＣＲ邐ＤＮＡ邋模板（５０ｎｇ／ｎｌ）邐２＾ｉｌ邐９４°Ｃ邋５ｍｉｎ逡逑ｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋３邋ｌｏｃｉ邐ｌＯ＾Ｔａｑ邋Ｂｕｆｆｅｒ邐２．５（ｉｌ邐９４邋Ｃ邋４０ｓ邐、逡逑Ｍｇ＾（２５ｍＭｅａｃｈ）邐２．５＾１邐６２＂Ｃ（每循環(huán)降邋０．５。0邋ｌｍｉｎ邋＾０ｒ逡逑７２邋°Ｃ邋ｌｍｉｎ逡逑ｄＮＴＰ（２ｍＭ邋ｅａｃｈ）邐２．５ｕｌ邐＾逡逑９４邋°Ｃ邐４０ｓ邐＂逡逑Ｐｒｉｍｅｒ（ｌＯｕＭｅａｃｈ）邋ＴＵＭＸＬｖ８．２５６邐０．２ｕｌ逡逑５８邋Ｃ邋１邋ｍｉｎ邐ｙ邋１５ｒ逡逑ＴＵＭＸＬｖ８．２２０邐０．２５＾１邐７２°Ｃ邐ｌｍｉｎ逡逑ＴＵＭＸＬｖ７．５６邐０．３＾１邐９４邋＂Ｃ邐４０ｓ邐＂逡逑}0酶（２．５Ｕ／ｆｉｌ）邐０．３＾１邐５５＃Ｃ邋ｌｍｉｎ邐＞邋１５ｒ逡逑ｄｄＨ２０邐１３．７＾１邐７２°Ｃ邐ｌｍｉｎ邐＞逡逑７２邋°Ｃ邐５ｍｉｎ逡逑４0Ｃ邋Ｈｏｌｄ逡逑基因分型結(jié)果顯示，４組凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星多重ＰＣＲ反應(yīng)體系均可以獲得逡逑較好的擴(kuò)增效果。其中，五重ＰＣＲ、四重ＰＣＲ１和四重ＰＣＲ２的基因分型峰值圖逡逑分別見(jiàn)圖２－２、圖２－３和圖２－４。１１個(gè)凡納濱對(duì)蝦家系在１６個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基逡逑因型信息見(jiàn)附表１。逡逑８０邐１６０邐２４０邐３２０邐４００邐４８０逡逑２４０００＋邐＊邐１邐＂Ｉ邐邐邋邐邐邐邐邐邐邐邐邐逡逑

］逡逑在親本總數(shù)為２０個(gè)，置信度為９５％的情況下，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了邋４組微衛(wèi)星多重逡逑ＰＣＲ體系親權(quán)鑒定的準(zhǔn)確率。如圖２－５所示，隨著不斷累加多重ＰＣＲ體系，其逡逑親權(quán)鑒定準(zhǔn)確率逐漸提高，當(dāng)同時(shí)使用４組多重ＰＣＲ體系進(jìn)行親權(quán)分析時(shí)，無(wú)逡逑論親本性別是否已知，其親權(quán)鑒定準(zhǔn)確率均為１００％。半同胞和全同胞家系均鑒逡逑別效果良好，驗(yàn)證結(jié)果與模擬結(jié)果基本吻合，說(shuō)明親權(quán)分析的結(jié)果具有較高的準(zhǔn)逡逑確度和可信度。逡逑２６逡逑

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本文編號(hào)：2757763