【摘要】：合浦珠母貝(Pinctada fucata),是我國海水珍珠養(yǎng)殖的主要貝類,著名“南珠”即為其所產(chǎn)。近年來,由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化、疾病蟲害以及種質(zhì)退化等原因?qū)е潞掀种槟肛愓渲楫a(chǎn)量及質(zhì)量下降。幾丁質(zhì)是貝殼形成的的三大重要成分之一,而幾丁質(zhì)酶又是幾丁質(zhì)的調(diào)控蛋白。章魚胺受體廣泛存在于無脊椎動(dòng)物中,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)肌源性節(jié)奏收縮、調(diào)節(jié)cAMP水平、參與磷酸化途徑等多種重要功能。為探究幾丁質(zhì)酶基因與章魚胺受體基因在合浦珠母貝生長(zhǎng)發(fā)育及貝殼形成過程中的作用,本研究根據(jù)合浦珠母貝的高通量測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),克隆了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因與章魚胺受體基因,并通過不同組織的表達(dá)分析、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析、破殼誘導(dǎo)表達(dá)分析和原位雜交實(shí)驗(yàn)推測(cè)了這兩個(gè)基因的表達(dá)特性及生理功能。初步探討了它們?cè)诤掀种槟肛惿L(zhǎng)、發(fā)育以及貝殼修復(fù)過程中的作用,為進(jìn)一步開展合浦珠母貝的繁育與育珠工作提供了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.合浦珠母貝Pf-Chi1基因的克隆與表達(dá)分析本研究根據(jù)合浦珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選到一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因片段,通過5’-RACE和3’-RACE技術(shù)得到了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因的cDNA全長(zhǎng),命名為Pf-Chi1(GenBank登錄號(hào):KT956975)。Pf-Chi1基因cDNA序列全長(zhǎng)為2743bp,5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為47bp,開放閱讀框?yàn)?187bp,3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為509bp,具有一個(gè)加尾信號(hào)(AATAAA)。該基因編碼728個(gè)氨基酸,蛋白的預(yù)測(cè)分子量為78.41kDa,理論等電點(diǎn)(PI)為5.57,包含一個(gè)長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白具有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:1個(gè)N端催化結(jié)構(gòu)域(GH18糖水解結(jié)構(gòu)域)和3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM14結(jié)構(gòu)域);幾丁質(zhì)酶-1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,Pf-Chi1與其他物種Chi1具有同源性,相似度為22.43-31.4%,其中與太平洋牡蠣的相似性最高為31.4%;系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,Pf-Chi1歸類于雙殼綱且與太平洋牡蠣Chi1聚為一支,說明Pf-Chi1屬于雙殼綱Chi1家族。實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在合浦珠母貝的外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、血液、腸和性腺中均有表達(dá),并且在外套膜中的表達(dá)量最高,在腸中表達(dá)量最低。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在擔(dān)輪期、d型期、殼頂期、眼點(diǎn)期和變態(tài)期5個(gè)時(shí)期中均有表達(dá),且在擔(dān)輪期幼蟲的表達(dá)量極顯著的高于其他4個(gè)時(shí)期。上述結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的生長(zhǎng)發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起著重要作用。利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)pf-chi1基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個(gè)不同時(shí)間段在外套膜中的表達(dá)情況。破殼誘導(dǎo)表達(dá)qrt-pcr分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna的表達(dá)量在破殼后先逐漸降低,在24h時(shí)顯著增加(p0.05),隨后逐漸降低到正常水平。上述結(jié)果表明,pf-chi1基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長(zhǎng)與修復(fù)過程中起重要作用。外套膜組織原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pf-chi1基因在外套膜邊緣內(nèi)褶的外表皮細(xì)胞有較強(qiáng)的雜交信號(hào)出現(xiàn),內(nèi)褶的內(nèi)表皮細(xì)胞與中褶的內(nèi)表皮細(xì)胞有少量雜交信號(hào)出現(xiàn),陰性對(duì)照沒有雜交信號(hào)出現(xiàn)。以上結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的貝殼形成與修復(fù)過程中起重要的作用。2.合浦珠母貝pfoar基因的克隆與表達(dá)分析本研究克隆獲得了合浦珠母貝章魚胺受體基因的cdna全長(zhǎng),命名為pfoar(genbank登錄號(hào):kx082720)。pfoar基因cdna序列全長(zhǎng)為1890bp,5'非翻譯區(qū)(5'-utr)為113bp,開放閱讀框?yàn)?659bp,3'非翻譯區(qū)(3'-utr)為118bp。該基因編碼552個(gè)氨基酸,蛋白的預(yù)測(cè)分子量為63.167kda,理論等電點(diǎn)(pi)為9.19。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,具有g(shù)蛋白偶聯(lián)受體的共性。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,pfoar與其他物種oar蛋白具有較高的同源性;系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,pfoar與太平洋牡蠣oar聚為一支。qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示,pfoarmrna在合浦珠母貝的外套膜、珍珠囊、腸、肝胰腺、鰓和閉殼肌中均有表達(dá),并且在外套膜中的表達(dá)量最高。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析結(jié)果顯示,pfoarmrna在擔(dān)輪期、d型期、殼頂期、眼點(diǎn)期和變態(tài)期5個(gè)時(shí)期中均有表達(dá),且在變態(tài)期幼蟲的表達(dá)量顯著的高于其他4個(gè)時(shí)期。上述結(jié)果表明pfoar基因可能在合浦珠母貝的生長(zhǎng)發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起重要作用。利用qrt-pcr技術(shù)檢測(cè)pfoar基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個(gè)不同時(shí)間段在外套膜中的表達(dá)情況。破殼誘導(dǎo)表達(dá)qrt-pcr的分析結(jié)果顯示,pfoarmrna的表達(dá)量在破殼后的第36h顯著升高(p0.05)。上述結(jié)果表明,pfoar基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長(zhǎng)與修復(fù)過程中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 合浦珠母貝研究概況1.1.1 合浦珠母貝簡(jiǎn)介合浦珠母貝（Pinctada fucata），又稱馬氏珠母貝，隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、珍珠貝目（Pterioida）、珍珠貝科（Pteriidae）、珠母貝屬（Pinctada）[1]，是生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類之一（圖 1-1），聞名遐邇的“南珠”即為其所產(chǎn)。合浦珠母貝是中國以及世界上重要的海水養(yǎng)殖貝類，主要分布在我國的廣東、廣西、海南以及臺(tái)灣等沿海地區(qū)。合浦珠母貝具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，除用于生產(chǎn)珍珠外，其肉亦可食用，貝殼可加工為裝飾品、藥品和化妝品等材料。

圖 1-2 合浦珠母貝貝殼結(jié)構(gòu)示意圖貝殼結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次為角質(zhì)層、棱柱層、珍珠層。Fig. 1-2 Shell structure of Pinctada fucataFrom outside to inside are respectively Cuticle layer, Prismatic layer and Nacreous layer角質(zhì)層是軟體動(dòng)物形成的最早的保護(hù)層，由不溶性的蛋白和有機(jī)色素構(gòu)成。質(zhì)層為貝殼的礦化層的形成提供了密閉的環(huán)境和礦化界面，另外還可以保護(hù)貝的礦化層不受酸性物質(zhì)的侵蝕[5]。碳酸鈣晶體分為文石和方解石兩種類型，其棱柱層為方解石層，珍珠層為文石層。從結(jié)構(gòu)圖可以看到，棱柱層位于角質(zhì)層層，珍珠層位于棱柱層內(nèi)層，珍珠層靠近外套膜。.1.3 合浦珠母貝的礦化器官——外套膜外套膜位于貝殼內(nèi)側(cè)，由上皮組織、結(jié)締組織和少量神經(jīng)組織構(gòu)成。外套膜軟體動(dòng)物中具有很多功能，包括儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)，感知水流和攝食等[6]，是軟體動(dòng)物主要的礦化器官[7]。一般根據(jù)距離貝殼邊緣的遠(yuǎn)近，將外套膜分為外套膜邊緣（mantle edge）,外套膜緣膜區(qū)（mantle pallial）和外套膜中心區(qū)（mantle center）。

圖 1-3 礦化器官外套膜結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1-3 Mantle structure mineralization.4 合浦珠母貝的研究現(xiàn)狀近年來，由于長(zhǎng)期的人工繁育、海水養(yǎng)殖環(huán)境的污染、病害、蟲害等原因?qū)种槟肛惙N質(zhì)衰退，成活率降低，個(gè)體變小以及育珠質(zhì)量下降[2]，給我國的珍珠養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。為此科學(xué)工作者們，全身心的投入了培育珠母貝優(yōu)良品種和優(yōu)質(zhì)珍珠繁育的生產(chǎn)實(shí)踐與分子實(shí)驗(yàn)研究中。目前國內(nèi)外

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本文編號(hào)：2758134