【摘要】：合浦珠母貝(Pinctada fucata),是我國海水珍珠養(yǎng)殖的主要貝類,著名“南珠”即為其所產(chǎn)。近年來,由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化、疾病蟲害以及種質(zhì)退化等原因?qū)е潞掀种槟肛愓渲楫a(chǎn)量及質(zhì)量下降。幾丁質(zhì)是貝殼形成的的三大重要成分之一,而幾丁質(zhì)酶又是幾丁質(zhì)的調(diào)控蛋白。章魚胺受體廣泛存在于無脊椎動物中,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)肌源性節(jié)奏收縮、調(diào)節(jié)cAMP水平、參與磷酸化途徑等多種重要功能。為探究幾丁質(zhì)酶基因與章魚胺受體基因在合浦珠母貝生長發(fā)育及貝殼形成過程中的作用,本研究根據(jù)合浦珠母貝的高通量測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),克隆了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因與章魚胺受體基因,并通過不同組織的表達分析、不同發(fā)育時期的表達分析、破殼誘導(dǎo)表達分析和原位雜交實驗推測了這兩個基因的表達特性及生理功能。初步探討了它們在合浦珠母貝生長、發(fā)育以及貝殼修復(fù)過程中的作用,為進一步開展合浦珠母貝的繁育與育珠工作提供了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.合浦珠母貝Pf-Chi1基因的克隆與表達分析本研究根據(jù)合浦珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選到一個幾丁質(zhì)酶基因片段,通過5’-RACE和3’-RACE技術(shù)得到了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因的cDNA全長,命名為Pf-Chi1(GenBank登錄號:KT956975)。Pf-Chi1基因cDNA序列全長為2743bp,5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為47bp,開放閱讀框為2187bp,3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為509bp,具有一個加尾信號(AATAAA)。該基因編碼728個氨基酸,蛋白的預(yù)測分子量為78.41kDa,理論等電點(PI)為5.57,包含一個長度為19個氨基酸的信號肽。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有4個保守結(jié)構(gòu)域:1個N端催化結(jié)構(gòu)域(GH18糖水解結(jié)構(gòu)域)和3個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM14結(jié)構(gòu)域);幾丁質(zhì)酶-1氨基酸序列比對結(jié)果顯示,Pf-Chi1與其他物種Chi1具有同源性,相似度為22.43-31.4%,其中與太平洋牡蠣的相似性最高為31.4%;系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,Pf-Chi1歸類于雙殼綱且與太平洋牡蠣Chi1聚為一支,說明Pf-Chi1屬于雙殼綱Chi1家族。實時熒光定量pcr(qrt-pcr)分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在合浦珠母貝的外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、血液、腸和性腺中均有表達,并且在外套膜中的表達量最高,在腸中表達量最低。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時期的表達分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在擔(dān)輪期、d型期、殼頂期、眼點期和變態(tài)期5個時期中均有表達,且在擔(dān)輪期幼蟲的表達量極顯著的高于其他4個時期。上述結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的生長發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起著重要作用。利用實時熒光定量pcr技術(shù)檢測pf-chi1基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個不同時間段在外套膜中的表達情況。破殼誘導(dǎo)表達qrt-pcr分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna的表達量在破殼后先逐漸降低,在24h時顯著增加(p0.05),隨后逐漸降低到正常水平。上述結(jié)果表明,pf-chi1基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長與修復(fù)過程中起重要作用。外套膜組織原位雜交實驗結(jié)果顯示,pf-chi1基因在外套膜邊緣內(nèi)褶的外表皮細胞有較強的雜交信號出現(xiàn),內(nèi)褶的內(nèi)表皮細胞與中褶的內(nèi)表皮細胞有少量雜交信號出現(xiàn),陰性對照沒有雜交信號出現(xiàn)。以上結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的貝殼形成與修復(fù)過程中起重要的作用。2.合浦珠母貝pfoar基因的克隆與表達分析本研究克隆獲得了合浦珠母貝章魚胺受體基因的cdna全長,命名為pfoar(genbank登錄號:kx082720)。pfoar基因cdna序列全長為1890bp,5'非翻譯區(qū)(5'-utr)為113bp,開放閱讀框為1659bp,3'非翻譯區(qū)(3'-utr)為118bp。該基因編碼552個氨基酸,蛋白的預(yù)測分子量為63.167kda,理論等電點(pi)為9.19。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域,具有g(shù)蛋白偶聯(lián)受體的共性。氨基酸序列比對結(jié)果顯示,pfoar與其他物種oar蛋白具有較高的同源性;系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,pfoar與太平洋牡蠣oar聚為一支。qrt-pcr檢測結(jié)果顯示,pfoarmrna在合浦珠母貝的外套膜、珍珠囊、腸、肝胰腺、鰓和閉殼肌中均有表達,并且在外套膜中的表達量最高。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時期的表達分析結(jié)果顯示,pfoarmrna在擔(dān)輪期、d型期、殼頂期、眼點期和變態(tài)期5個時期中均有表達,且在變態(tài)期幼蟲的表達量顯著的高于其他4個時期。上述結(jié)果表明pfoar基因可能在合浦珠母貝的生長發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起重要作用。利用qrt-pcr技術(shù)檢測pfoar基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個不同時間段在外套膜中的表達情況。破殼誘導(dǎo)表達qrt-pcr的分析結(jié)果顯示,pfoarmrna的表達量在破殼后的第36h顯著升高(p0.05)。上述結(jié)果表明,pfoar基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長與修復(fù)過程中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【圖文】：

第一章 文獻綜述1.1 合浦珠母貝研究概況1.1.1 合浦珠母貝簡介合浦珠母貝（Pinctada fucata），又稱馬氏珠母貝，隸屬于軟體動物門（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、珍珠貝目（Pterioida）、珍珠貝科（Pteriidae）、珠母貝屬（Pinctada）[1]，是生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類之一（圖 1-1），聞名遐邇的“南珠”即為其所產(chǎn)。合浦珠母貝是中國以及世界上重要的海水養(yǎng)殖貝類，主要分布在我國的廣東、廣西、海南以及臺灣等沿海地區(qū)。合浦珠母貝具有重要的經(jīng)濟價值，除用于生產(chǎn)珍珠外，其肉亦可食用，貝殼可加工為裝飾品、藥品和化妝品等材料。

圖 1-2 合浦珠母貝貝殼結(jié)構(gòu)示意圖貝殼結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次為角質(zhì)層、棱柱層、珍珠層。Fig. 1-2 Shell structure of Pinctada fucataFrom outside to inside are respectively Cuticle layer, Prismatic layer and Nacreous layer角質(zhì)層是軟體動物形成的最早的保護層，由不溶性的蛋白和有機色素構(gòu)成。質(zhì)層為貝殼的礦化層的形成提供了密閉的環(huán)境和礦化界面，另外還可以保護貝的礦化層不受酸性物質(zhì)的侵蝕[5]。碳酸鈣晶體分為文石和方解石兩種類型，其棱柱層為方解石層，珍珠層為文石層。從結(jié)構(gòu)圖可以看到，棱柱層位于角質(zhì)層層，珍珠層位于棱柱層內(nèi)層，珍珠層靠近外套膜。.1.3 合浦珠母貝的礦化器官——外套膜外套膜位于貝殼內(nèi)側(cè)，由上皮組織、結(jié)締組織和少量神經(jīng)組織構(gòu)成。外套膜軟體動物中具有很多功能，包括儲存營養(yǎng)，感知水流和攝食等[6]，是軟體動物主要的礦化器官[7]。一般根據(jù)距離貝殼邊緣的遠近，將外套膜分為外套膜邊緣（mantle edge）,外套膜緣膜區(qū)（mantle pallial）和外套膜中心區(qū)（mantle center）。

圖 1-3 礦化器官外套膜結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1-3 Mantle structure mineralization.4 合浦珠母貝的研究現(xiàn)狀近年來，由于長期的人工繁育、海水養(yǎng)殖環(huán)境的污染、病害、蟲害等原因?qū)种槟肛惙N質(zhì)衰退，成活率降低，個體變小以及育珠質(zhì)量下降[2]，給我國的珍珠養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。為此科學(xué)工作者們，全身心的投入了培育珠母貝優(yōu)良品種和優(yōu)質(zhì)珍珠繁育的生產(chǎn)實踐與分子實驗研究中。目前國內(nèi)外

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本文編號：2758134