【摘要】：羅非魚是世界重要的淡水魚類養(yǎng)殖品種,其性成熟時間早,性成熟后產(chǎn)卵周期短,并且雄魚比雌魚更具生長優(yōu)勢,如果雌雄混養(yǎng)會因群體內(nèi)自繁進而造成羅非魚養(yǎng)殖密度過大,規(guī)格參差不齊,對羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成巨大影響,因此目前羅非魚的商業(yè)化生產(chǎn)主要依靠雄性的單性養(yǎng)殖。羅非魚“粵閩1號”是由本研究團隊培育的全雄羅非魚新品種,該品種羅非魚為遺傳雄魚,不直接經(jīng)過激素處理,具有優(yōu)良的生長性能。在羅非魚“粵閩1號”的育種路線中,XY轉(zhuǎn)化雌魚以及YY_1超雄魚等基因型羅非魚需要通過傳統(tǒng)的測交實驗進行鑒定,但測交篩選YY超雄魚的過程復(fù)雜、周期長。本研究通過對尼羅羅非魚最佳雌化條件進行探索,培育XY轉(zhuǎn)化雌魚和YY超雄魚,并篩選羅非魚性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定XY轉(zhuǎn)化雌魚和YY超雄魚,其目的有二:一方面縮短羅非魚“粵閩1號”育種周期并降低成本,另一方面為羅非魚遺傳性別的鑒定提供參考。取得的主要成果如下:1.尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選應(yīng)用24對微衛(wèi)星引物,首先使用常規(guī)PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法在兩個尼羅羅非魚群體和兩個奧利亞羅非魚群體中篩選到UNH931、GM128、GM201、GM258、GM597以及UNH898共6個與性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記。之后使用降落PCR以及毛細管電泳的方法在兩個尼羅羅非魚群體、兩個奧利亞羅非魚群體以及ZY_1、WY_1、YY_1和YY_2型羅非魚群體中進一步擴增這6個微衛(wèi)星標(biāo)記,統(tǒng)計各群體的遺傳多樣性參數(shù):6個微衛(wèi)星標(biāo)記在上述群體共298個樣本中共檢測到95個等位基因,其大小在97~302 bp之間,各位點在各群體等位基因數(shù)在1~13個之間,各群體平均觀測等位基因數(shù)為2.167~9.333,平均有效等位基因數(shù)為1.624~4.966,平均觀測雜合度為0.324~0.983,平均期望雜合度為0.329~0.782,平均多態(tài)信息含量為0.275~0.753,兩個尼羅羅非魚群體、WY_1和YY_2群體達到高度多態(tài)(PIC0.5),兩個奧利亞羅非魚群體、ZY_1和YY_1群體為中度多態(tài)(0.25PIC0.5)。聚類分析顯示所有群體聚為兩大支,兩個奧利亞羅非魚群體以及ZY1群體聚為一支,兩個尼羅羅非魚群體、WY_1、YY_1以及YY_2群體聚為另一支。進行性別關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn):GM597與尼羅羅非魚無錫群體、尼羅羅非魚高要群體以及奧利亞羅非魚番禺群體的性別顯著相關(guān)(P0.05),UNH898與尼羅羅非魚高要群體的性別極顯著相關(guān)(P0.01)。利用GM597與UNH898聯(lián)合分析可100%鑒定兩個尼羅羅非魚群體的性別。由于GM597與兩個尼羅羅非魚群體的性別均達到顯著相關(guān),可將GM597作為篩選XY轉(zhuǎn)化雌魚和YY超雄魚的候選標(biāo)記。2.吉富羅非魚雌化條件的探索及微衛(wèi)星標(biāo)記GM597的擴增驗證以經(jīng)過測交驗證基因型的吉富羅非魚為親本構(gòu)建全同胞家系,33~#XX雌魚與36~#YY超雄魚雜交獲得S1家系,33~#XX雌魚同31~#XY雄魚雜交獲得S2家系、30~#XX雌魚同31~#XY雄魚雜交獲得S3家系。將每個家系受精后1天(1 day post-fertilization,1dpf)的胚胎分成4個處理組進行雌化處理,雌化處理包括激素浸泡和激素投喂兩種方式。對照組不作處理。實驗1組的處理為1 dpf胚胎苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)浸泡4 h,仔魚開口后正常投喂。實驗2組的處理為胚胎不做處理,仔魚開口后EB拌料共投喂60 d。實驗3組的處理為1 dpf胚胎EB浸泡4 h,仔魚開口后EB拌料共投喂60 d。結(jié)果顯示:S1家系對照組的雌雄比例接近0:1的理論值,S2和S3兩個家系對照組的雌雄比例接近1:1的理論值;3個家系實驗1組的雌雄比例均接近2:1,平均雌性率為66.76%;3個家系實驗2組的雌雄比例大約為1:0,平均雌性率為94.34%;3個家系實驗3組的雌雄比例大約為1:0,平均雌性率為94.64%。實驗2組以及實驗3組的雌性率最高且相差不大,鑒于操作的簡便性,在后續(xù)實驗中可采用實驗2組的雌化方式。在3個吉富羅非魚全同胞家系及其親本中擴增GM597,通過分析發(fā)現(xiàn)其127 bp大小的等位基因與3個家系羅非魚的X染色體連鎖,137 bp大小的等位基因與3個家系羅非魚的Y染色體連鎖。3.XY型轉(zhuǎn)化雌魚和YY型超雄羅非魚的培育及其遺傳性別的鑒定將吉富羅非魚混合群體分為兩組,每組約1000尾,實驗組EB拌料投喂60 d,對照組正常投喂,結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組的雌性率為48.23%,實驗組的雌性率為95%。從實驗組中挑選166個樣本,利用GM597共篩選到XY型轉(zhuǎn)化雌魚75尾。利用已知遺傳性別的吉富羅非魚雄魚和篩選到的XY型轉(zhuǎn)化雌魚作為候選親本進行雜交實驗。7~#XY轉(zhuǎn)化雌魚與36~#YY超雄魚雜交獲得S4家系,11~#XY轉(zhuǎn)化雌魚同31~#XY雄魚雜交獲得S5家系,19~#XX雌魚同28~#XY雄魚雜交獲得S6家系。采用干法授精,并在孵化裝置中進行受精卵的孵化,待仔魚開口后開始投喂餌料,在每個家系中隨機挑選150個子代擴增GM597,根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn):S4家系的150個子代中有XY型羅非魚72尾,YY型羅非魚78尾,兩者之比接近理論值1:1。S5家系的150個子代中有XX型羅非魚36尾,XY型羅非魚75尾,YY型羅非魚41尾,三者之比接近理論值1:2:1。S6家系的150個子代中有XX型羅非魚38尾,XY型羅非魚73尾,YY型羅非魚39尾,三者之比接近理論值1:2:1。本實驗成功利用GM597篩選到了YY型超雄羅非魚。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S965.125
【圖文】：

圖 1-1 所有羅非魚群體的聚類分析圖Fig.1-1 Cluster dengrogram of all tilapia populations3.2.4 性別相關(guān)微衛(wèi)星位點的篩選將初步篩選到的 6 個與性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記進一步在 12 個群體中擴增后現(xiàn)：GM597 與尼羅羅非魚無錫群體、尼羅羅非魚高要群體以及奧利亞羅非魚番群體的性別顯著相關(guān)（P<0.05），鑒別率（鑒別率=群體內(nèi)可準(zhǔn)確鑒定性別的個體/群體內(nèi)個體總數(shù)×100%）分別為 39.1%、60.5%與 7.5%；UNH898 與尼羅羅非高要群體的性別極顯著相關(guān)（P<0.01），鑒別率為 71.1%。將 GM597 與 UNH898合分析可 100%鑒定兩個尼羅羅非魚群體的性別。將 GM597 與 GM258 在奧利亞非魚無錫群體和奧利亞羅非魚番禺群體中聯(lián)合分析，兩個群體的雌雄鑒別率分為 33.3%和 40.0%。詳細結(jié)果見表 1-6~表 1-10。

位點 Locus鑒別率 Identification rates奧利亞羅非魚無錫群體O. aureus population of Wuxi奧利亞羅非魚番禺群體Panyu O. aureus populationGM597 2/24（8.3%） 3/40（7.5%）GM258 1/24（4.2%） 1/40（2.5%）GM597-GM258 8/24（33.3%） 16/40（40%）3.3 GM597 與 UNH898 的連鎖分析在奧利亞羅非魚番禺群體中 GM597 與 UNH898 存在高度連鎖，GM597 的 99bp 大小的等位基因與 UNH898 的 280 bp 大小的等位基因連鎖，GM597 的 111 bp大小的等位基因與 UNH898 的 234bp 大小的等位基因連鎖，GM597 與 UNH898 在奧利亞羅非魚番禺群體中的擴增結(jié)果見圖 1-2。在 YY1羅非魚群體中 GM597 與 UNH898 也存在一定程度連鎖，GM597 的 127bp 大小的等位基因與 UNH898 的 284 bp 大小的等位基因連鎖，GM597 的 137 bp大小的等位基因與 UNH898 的 246bp 大小的等位基因連鎖，GM597 與 UNH898 在YY1羅非魚群體中的擴增結(jié)果見圖 1-3。

大小的等位基因與 UNH898 的 234bp 大小的等位基因連鎖，GM597 與 UNH898 在奧利亞羅非魚番禺群體中的擴增結(jié)果見圖 1-2。在 YY1羅非魚群體中 GM597 與 UNH898 也存在一定程度連鎖，GM597 的 127bp 大小的等位基因與 UNH898 的 284 bp 大小的等位基因連鎖，GM597 的 137 bp大小的等位基因與 UNH898 的 246bp 大小的等位基因連鎖，GM597 與 UNH898 在YY1羅非魚群體中的擴增結(jié)果見圖 1-3。圖 1-2 GM597 與 UNH898 在奧利亞羅非魚番禺群體中擴增結(jié)果Fig.1-2Amplification results of GM597 and UNH898 in the O. aureus population ofPanyu

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本文編號：2757413