【摘要】：三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,在我國(guó)廣泛分布。鹽度是三疣梭子蟹養(yǎng)殖的重要環(huán)境因子,目前養(yǎng)殖主要在室外養(yǎng)殖,鹽度是三疣梭子蟹養(yǎng)殖中的重要環(huán)境因子,由于陰雨天氣及大換水等常會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖水體鹽度急劇變化,使得三疣梭子蟹產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),生理代謝紊亂,進(jìn)而免疫力下降,極易引起疾病的爆發(fā),甚至大量死亡。由于工廠大量建設(shè),養(yǎng)殖面積逐年減少,為改變這種情況,充分利用新開(kāi)發(fā)的大量低鹽池塘,黃海所開(kāi)展了耐低鹽新品種選育。但在不同低鹽脅迫下對(duì)三疣梭子蟹細(xì)胞凋亡的研究上還未見(jiàn)報(bào)道,因此比較三疣梭子蟹不同生長(zhǎng)階段低鹽耐受能力,探討不同低鹽脅迫下凋亡情況的分子機(jī)制,并進(jìn)行分析,對(duì)三疣梭子蟹養(yǎng)殖和育種具有重要意義。此外,由于水體環(huán)境污染加重,造成其病害也日趨嚴(yán)重,已有研究表明,副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)能導(dǎo)致三疣梭子蟹組織病變甚至死亡。當(dāng)病原感染后,甲殼類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞凋亡數(shù)量在組織中頻率上升,從而引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),說(shuō)明細(xì)胞凋亡能發(fā)揮作用來(lái)應(yīng)對(duì)病毒感染,目前在三疣梭子蟹中尚未見(jiàn)凋亡通路上的報(bào)道,研究病原感染對(duì)三疣梭子蟹細(xì)胞凋亡研究具有指導(dǎo)意義。研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)部分:一、三疣梭子蟹P53、Apaf-1、Bcl-2基因的克隆及序列分析。P53基因是一種重要的腫瘤抑制基因,1979年首次報(bào)道,但隨著研究的深入,逐漸發(fā)現(xiàn)P53基因起到抑癌基因的功能。P53基因作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因子,在決定細(xì)胞對(duì)DNA損傷、缺氧和致癌信號(hào)等應(yīng)激的反應(yīng)中起著核心作用。P53一旦被激活,就會(huì)促進(jìn)超過(guò)150個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、腫瘤抑制、基因組穩(wěn)定、細(xì)胞自噬和DNA修復(fù)等。Bcl-2基因是Bcl-2家族中非常重要的基因,該基因的功能是抑制凋亡的發(fā)生,Bcl-2家族蛋白主要通過(guò)影響線粒體外膜的通透性的改變參與到線粒體的凋亡途徑,Bc1-2蛋白通過(guò)改變線粒體膜電位的變化調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,從而抑制細(xì)胞凋亡。凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1蛋白),在線粒體介導(dǎo)的凋亡過(guò)程中起核心作用,多種信號(hào)通路都須先作用于Apaf-1,然后在引發(fā)下游的凋亡事件,Apaf-1是發(fā)育性程序化細(xì)胞死亡的重要組成部分。應(yīng)用RACE克隆技術(shù)獲得三疣梭子蟹P53、Apaf-1、Bcl-2基因全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明:三疣梭子蟹P53基因全長(zhǎng)為cDNA序列全長(zhǎng)為1544bp,其中ORF為1314bp,編碼437個(gè)氨基酸(GenBank NO.MH155954),序列中含有168 bp的5’端非編碼區(qū)(UTR)和230 bp的3’端UTR,3’端存在多聚腺苷酸Poly A尾。ExPASy ProtParam tool在線軟件分析顯示,三疣梭子蟹P53基因編碼一個(gè)由437個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),該蛋白預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)為5.47,分子量為49.6 kDa。不穩(wěn)定系數(shù)為51.61,屬于不穩(wěn)定蛋白。三疣梭子蟹Bcl-2基因cDNA序列全長(zhǎng)為2015bp,其中ORF為849bp,編碼282個(gè)氨基酸(GenBank NO.MH155953),序列中含有565bp的5’端非編碼區(qū)(UTR)和602 bp的3’端UTR,3’端存在多聚腺苷酸Poly A尾.含有Bcl-2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜區(qū)。三疣梭子蟹Apaf-1基因cDNA序列全長(zhǎng)為2032bp,其中ORF為1050bp,共編碼349個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為39.13 kDa,理論等電點(diǎn)為7.67。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,Apaf-1與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的同源性最高為51.27%,表明其在進(jìn)化上具有一定的保守性。組織表達(dá)分布,P53基因在鰓和眼柄中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為肝胰腺,在心臟中表達(dá)水平最低;Bcl-2基因在肌肉中表達(dá)量最高,表皮中表達(dá)量最低;Apaf-1基因在肝胰腺中表達(dá)量最高,表皮中表達(dá)量最低。二、三疣梭子蟹鹽度脅迫后P53、Bcl-2、Apaf-1基因的功能研究Ⅱ期幼蟹在低鹽脅迫下,P53基因的表達(dá)在3h上調(diào)基因表達(dá),12h到達(dá)峰值;Bcl-2基因的表達(dá)在呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢(shì);Apaf-1基因的表達(dá)在3h上調(diào)基因表達(dá)量,3h后隨著時(shí)間的推移,表達(dá)量呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。運(yùn)用石蠟切片進(jìn)行低鹽脅迫下鰓組織的tunel檢測(cè),表明低鹽脅迫能使細(xì)胞的凋亡率發(fā)生變化,80日齡時(shí)P53基因在低鹽脅迫下鰓組織的表達(dá)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),整體高于對(duì)照組,在肝胰腺中P53基因的表達(dá)呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì);80日齡時(shí)Bcl-2基因在低鹽脅迫后鰓組織從3h起,一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),在肝胰腺中Bcl-2呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),并在72小時(shí)達(dá)到對(duì)照水平。鹽度脅迫后,鰓組織中Apaf-1基因表達(dá)量總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),鹽度11的表達(dá)量均低于對(duì)照組,在肝胰腺中該基因在20鹽度時(shí)的表達(dá)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),在12h到達(dá)峰值,72h恢復(fù)到對(duì)照組水平。在11鹽度脅迫后,肝胰腺組織中Apaf-1基因表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化,在12h到達(dá)峰值。利用siRNA干擾技術(shù)初步探究三疣梭子蟹P53與Bcl-2、Apaf-1基因之間的功能關(guān)系。結(jié)果表明,直接注射P53基因設(shè)計(jì)的siRNA具有較好的干擾效果。P53被干擾后可引起Apaf-1的下調(diào),P53被干擾后可引起B(yǎng)cl-2的顯著上調(diào),由此推測(cè),Apaf-1在對(duì)P53的調(diào)控過(guò)程中起著主導(dǎo)性作用;與此同時(shí),Bcl-2對(duì)P53有負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用。Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了P53多克隆抗體的特異性,并且P53蛋白灰度值分析結(jié)果與低鹽脅迫后表達(dá)基本一致,表明參與其反應(yīng)過(guò)程。上述結(jié)果表明,P53、Apaf-1和Bcl-2基因在三疣梭子蟹應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫過(guò)程中可能起著重要作用。三、三疣梭子蟹P53、Apaf-1和Bcl-2基因在病毒與細(xì)菌感染后的功能分析分別用白斑綜合癥病毒(WSSV)、副溶血弧菌對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行感染,用熒光定量RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞和肝胰腺中基因的表達(dá),結(jié)果表明:三疣梭子蟹血細(xì)胞感染副溶血弧菌后,P53基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),整體呈上調(diào)表達(dá),感染W(wǎng)SSV后,在72h到達(dá)峰值;肝胰腺在感染副溶血弧菌后,P53呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),在12h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的4.27倍,在感染W(wǎng)SSV病毒后,P53在24h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的1.5倍;三疣梭子蟹Bcl-2基因血細(xì)胞病原感染后,三疣梭子蟹血細(xì)胞病原感染后,副溶血弧菌的表達(dá)顯著低于對(duì)照組,WSSV基因表達(dá)在24h到達(dá)峰值,此時(shí)為對(duì)照組的1.58倍,肝胰腺在感染副溶血弧菌后,Bcl-2整體呈上調(diào)表達(dá)。在3h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的6.36倍,在感染W(wǎng)SSV病毒后,在48h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的5.92倍,整體呈上調(diào)表達(dá);三疣梭子蟹血細(xì)胞感染副溶血弧菌和WSSV病毒后,前者在48h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的2.76倍,后者12h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的1.25倍。肝胰腺在感染副溶血弧菌后,Apaf-1在72h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的5.44倍,在感染W(wǎng)SSV病毒后,Apaf-1呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),在12h到達(dá)峰值,為對(duì)照組的5.89倍。Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了P53蛋白灰度值分析結(jié)果跟病原感染后表達(dá)基本一致。由此推論,P53、Bcl-2和Apaf-1基因參與了三疣梭子蟹的免疫防御過(guò)程。推測(cè)該基因在三疣梭子蟹低鹽誘導(dǎo)和先天免疫過(guò)程中發(fā)揮重要功能,為三疣梭子蟹和其他甲殼動(dòng)物的凋亡通路的研究提供了理論指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S968.252
【圖文】：

圖 1 線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路簡(jiǎn)圖Figure 1 Summary of mitochondrial-mediated apoptosis pathway P53、Bcl-2、Apaf-1 基因的研究進(jìn)展P53 基因是一種重要的腫瘤抑制基因，被 Lane[38]于 1979 年首次報(bào)道，隨著研逐漸發(fā)現(xiàn) P53 基因能起到抑癌基因的作用[39]。P53 基因作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因，在細(xì)胞對(duì) DNA 損傷、缺氧和致癌信號(hào)等應(yīng)激的反應(yīng)中起著核心作用[40]。P5旦被激活，就會(huì)促進(jìn)超過(guò) 150 個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)胞周期、腫瘤抑制、基因組穩(wěn)定、細(xì)胞自噬和 DNA 修復(fù)等[41]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞或 DNA 受到損傷時(shí)，能夠刺激細(xì)胞內(nèi)的 P53 蛋白快速表達(dá)，在NA 損傷后，P53 能夠調(diào)節(jié)大量與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯止細(xì)胞惡性增殖，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[42]。P53 在誘導(dǎo)后可轉(zhuǎn)移到線粒體外膜直接與 Bcl-2 家族的促凋亡和抗凋亡成員相互作用[43,44]。P53 還可以誘導(dǎo) bax 基

圖 1-1. 三疣梭子蟹 P53 基因序列全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列方框內(nèi)框的 ATG 為起始密碼；*標(biāo)出的 TGA 為終止密碼子；畫(huà)線部分為 P53 保守結(jié)構(gòu)域Fig.1-1 P53 nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of P. trituberculatus .The initiation codons (ATG)is marked with black box.Asterisk indicates the termination codons(TGA).The conserved domain P53 is underlined三疣梭子蟹 P53 基因序列全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列Fig.1-1 P53 nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of P. trituberculatus .

圖 1-2 三疣梭子蟹 P53 氨基酸序列與其他物種 P53 氨基酸序列比對(duì)Fig. 1-2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of P.trituberculatus P53 withother species

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本文編號(hào)：2754616