【摘要】：動物腸道中存在著大量的微生物,在機體生長發(fā)育,營養(yǎng)代謝,免疫疾病等生物過程中扮演著重要的角色。隨著高通量測序和數(shù)據(jù)分析技術(shù)的快速發(fā)展,腸道微生物的研究進入一個更深入的層次�；蚪M測序結(jié)果表明正常動物腸道攜帶著大量病原微生物,正常情況下并未表現(xiàn)出致病性,但在腸道菌群紊亂時表現(xiàn)出強烈致病性,表明細(xì)菌性疾病的的發(fā)生可能依賴于腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和菌群之間的相互作用。氣單胞菌作為一類常見的淡水魚類病原菌,是引起細(xì)菌性敗血病主要病因,每年給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失。研究表明,氣單胞菌致病性受到外部環(huán)境的影響,而且氣單胞菌引起的敗血癥存在與其他腸道病原菌混合感染的現(xiàn)象,推測氣單胞菌感染依賴與腸道微生物的群落組成以及相互作用。故本研究選用抗菌藥干擾腸道菌群并結(jié)合高通量測序以及網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù),來研究斑馬魚腸道菌群協(xié)同競爭關(guān)系對嗜水氣單胞菌感染的影響,研究結(jié)果如下:1.抗菌藥對斑馬魚腸道菌群組成的影響斑馬魚腸道菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)組成。甲硝唑處理(J組)以及聯(lián)合處理組(L組,甲硝唑、頭孢他啶、左氧氟沙星聯(lián)合處理)后的2、7天都能顯著改變腸道菌群組成,主要是提高變形菌門比例和降低厚壁菌門以及梭桿菌門的比例,抗菌藥處理后17天,甲硝唑處理以及聯(lián)合處理對斑馬魚腸道菌群組成以及β-多樣性與對照組(Z組)相比無顯著差異。2.抗菌藥對斑馬魚腸道菌群網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的影響抗菌藥能夠使菌群形成不同的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,對比對照組,甲硝唑處理和聯(lián)合處理,都增加了網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點數(shù)(Z=329,J=361,L=571)以及連接數(shù)(Z=1123,J=1475,L=2781),使網(wǎng)絡(luò)關(guān)系變得更復(fù)雜。在17天時,甲硝唑處理以及對照組的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中存在更多的競爭關(guān)系(負(fù)/正連接數(shù)比,Z=0.21,J=0.32),而聯(lián)合處理組網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中存在更多協(xié)同關(guān)系(負(fù)/正連接數(shù)比,L=0.02)。3.斑馬魚腸道菌群中競爭協(xié)同關(guān)系對嗜水氣單胞菌感染的影響斑馬魚腸道菌群中與氣單胞菌存在協(xié)同關(guān)系有鯨桿菌屬(Cetobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)以及氣單胞菌屬(Aeromonas)等,與氣單胞菌存在競爭關(guān)系有埃希氏菌屬(Escherichia)、動球菌科未分類屬(Planococcaceae-unclassified)以及伯克氏菌未分類屬(Burkholderiales-unclassified)等。甲硝唑能夠增加與氣單胞菌潛在競爭種數(shù)量(P0.05),而聯(lián)合處理不僅能夠提高與氣單胞菌潛在競爭種數(shù)量(P0.01),還能降低與氣單胞菌潛在協(xié)同種的數(shù)量(P0.01),在17天,相比甲硝唑處理組以及對照組,聯(lián)合處理組存在大量與氣單胞菌潛在間接競爭種數(shù)量(P0.01),這可能是聯(lián)合處理提高斑馬魚存活率的原因。綜上所述,無論單獨處理和聯(lián)合處理在處理初期都能顯著改變腸道菌群組成和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,但對腸道網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的影響時間更長,聯(lián)合處理能夠顯著提高斑馬魚對嗜水氣單胞菌抵御力的原因可能是聯(lián)合處理能夠提高與氣單胞菌潛在競爭種數(shù)量并且降低與氣單胞菌潛在協(xié)同種數(shù)量,同時也表明腸道菌群依賴于整個網(wǎng)絡(luò)的相互作用來抵御病原菌的入侵,而非單一菌之間的相互作用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S941.42
【圖文】：

圖 2-1 實驗設(shè)計及采樣時間點Fig.2-1 Experimental design and sample time注：J 組代表甲硝唑處理，L 組代表甲硝唑、頭孢他啶、左氧氟沙星聯(lián)合處理，Z 組代表對照組流程圖表示 J、L、Z 處理后第 2 天為第一采樣點記為 day2,處理后第 7 天恢復(fù)為第二采樣點記day7,處理后第 17 天為第三采樣點記為 day17。Note: J, L, Z represents Metronidazole treatment group, Metronidazole, Ceftazidime and Levofloxaccombined treatment group, untreatment group respectively. day 2, 7, 17 represents different sampling tafter treatmet.2.1.4 采樣及 DNA 提取將斑馬魚用 MS-222（間位氨基苯甲酸乙酯）麻醉并處死，使用尖頭鑷子將其整腸道剝離，置于無水乙醇中，于-80℃冰箱保存，以備 DNA 提取。DNA 提取步驟按OMEGA 提取試劑盒說明書進行提取，具體步驟見附錄 A。2.1.5 腸道細(xì)菌總量定量用細(xì)菌 16S rRNA 保守區(qū)域設(shè)計引物，引物設(shè)計參考 Kasie（2017）為 27F （AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），355R（5'-CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'）

圖 2-2 腸道細(xì)菌總量定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2-2 standard curve of gut bacterial load quantitation量測序測序，擴增 16SrRNA 的 V4 區(qū)域，測序平臺為金唯智 IlluminaMiSeq分析原始數(shù)據(jù)處理使用 Mothur 軟件，計算平臺為西北農(nóng)林科技大學(xué)超，首先使用 fastqc 軟件查看 reads 各位置的堿基質(zhì)量值分布、堿基eads 各個位置上堿基分布比例、GC 含量分布、reads 各個位置的 測序接頭序列等。接著，使用 Trimmomatic 軟件去除測序接頭序 Mothur 流程進行雙端序列合并、過濾、比對以及聚類分析，詳thur.org/wiki/MiSeq_SOP）。α-多樣性及 β-多樣性數(shù)據(jù)處理使用 R 語計學(xué)分析使用 Graphpad prism 6 軟件。分析

第二章 抗菌藥對斑馬魚腸道菌群組成的影響比例，在抗菌藥處理后的第 7 天，對腸道菌群組成影響最大，其中的原因可能是殘留少量的抗菌藥對腸道菌群的持續(xù)作用（附錄 C，在抗菌藥處理的第 7 天，檢測有抗菌藥殘留），但處理后第 17 天，無論是聯(lián)合處理（L）處理還是甲硝唑處理（J），斑馬魚腸道菌群門水平的組成基本恢復(fù)到對照水平。

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本文編號：2753132