發(fā)布時間：2020-07-12 18:07

【摘要】：氧是決定絕大多數(shù)動物生存的關(guān)鍵環(huán)境因子。生活在潮間帶地區(qū)的牡蠣,由于周期性處于露空環(huán)境,經(jīng)常遭受低氧脅迫(溶氧量小于2.0 mg/L)。另外,由于全球變暖和水體富營養(yǎng)化,使得水體低氧現(xiàn)象頻發(fā),亦對牡蠣養(yǎng)殖造成低氧脅迫。因此,低氧已經(jīng)成為制約牡蠣健康養(yǎng)殖的重要環(huán)境因子。PHD-HIF通路是目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的唯一氧感知信號通路,闡明其作用機制對于解析牡蠣低氧脅迫響應(yīng)的分子機制具有重要指導(dǎo)作用。本研究通過構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選牡蠣低氧相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)HIF-α是低氧適應(yīng)過程中的關(guān)鍵基因。隨后,對牡蠣HIF家族進(jìn)行功能研究,闡明其在低氧脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。同時分析HIF與其羥化酶PHD的互作關(guān)系,驗證PHD的羥化酶活性及其對HIF-α的影響,以及HIF-α對PHD的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制。最后,通過分析HIF對低氧下糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,闡明長牡蠣低氧脅迫下的能量代謝機制。主要研究結(jié)果如下:1.HIF家族的鑒定及功能驗證。我們通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weighted correlation network analysis,WGCNA)法分析牡蠣干露表達(dá)譜數(shù)據(jù)。通過對篩選獲得的1330個差異基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,最終識別8個基因模塊。功能富集分析發(fā)現(xiàn)其中一個模塊主要富集在調(diào)控代謝方面,我們尋找該模塊的樞紐基因,發(fā)現(xiàn)HIF-α處于較核心位置,推測HIF-α是低氧適應(yīng)過程中的關(guān)鍵基因。隨后,對牡蠣HIF家族進(jìn)行功能驗證�？寺¤b定牡蠣體內(nèi)存在HIF家族的兩個α亞基和一個β亞基,尤其是發(fā)現(xiàn)一條新的HIF-α類似物CgHIFα-like,其C-端保守性較差,且具有四個不同的mRNA異構(gòu)體。qRT-PCR結(jié)果顯示,HIF家族成員均在鰓組織中表達(dá)量最高。低氧下,牡蠣HIF家族的兩個α亞基(CgHIF-α和CgHIFα-like)在mRNA和蛋白水平表達(dá)量均升高。而CgHIF-β的mRNA和蛋白水平不受低氧影響。另外,結(jié)合酵母雙雜交,熒光素酶雙報告和凝膠阻滯分析結(jié)果,證實CgHIF-α和CgHIFα-like蛋白均能夠與CgHIF-β形成異源二聚體,并通過結(jié)合在低氧反應(yīng)元件HRE上來轉(zhuǎn)錄激活低氧報告基因,表明牡蠣HIF家族成員具有低氧誘導(dǎo)因子功能活性。2.通過分析PHD酶的羥基化活性及其對HIF-α的影響,闡明PHD的氧感受機制。克隆鑒定兩個牡蠣PHD2(CgPHD2A和CgPHD2B)及一個CgVHL基因,其中CgPHD2B具有三種可變剪切形式,除CgPHD2B-iso1,CgPHD2B-iso2和iso3均編碼不完整蛋白。qRT-PCR結(jié)果顯示,CgPHD2A廣泛表達(dá)于各發(fā)育階段及成體各組織中,而CgPHD2B三個剪切體具有不同的時間表達(dá)模式,其中CgPHD2B-iso1在發(fā)育早期表達(dá)量最高,且在發(fā)育過程中表達(dá)量整體呈下降趨勢,而CgPHD2B-iso2和iso3表達(dá)量逐漸升高,表明具有功能活性的CgPHD2B-iso1可能參與細(xì)胞發(fā)育過程。功能研究表明,CgPHD2A能夠羥基化修飾CgHIF-α上的P404和P504位點,從而抑制CgHIF-α的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白水平,而且CgPHD2A對C-端的脯氨酸作用更強。通過構(gòu)建N-端缺失突變體,進(jìn)一步將CgPHD2A上與底物CgHIF-α結(jié)合相關(guān)的區(qū)域鎖定在aa 176-283區(qū)域,該區(qū)域包含β2β3環(huán)結(jié)構(gòu)域;而CgPHD2B蛋白不能夠羥基化修飾CgHIF-α,也不會影響CgHIF-α的轉(zhuǎn)錄活性,蛋白模型預(yù)測表明CgPHD2B與CgPHD2A的主要區(qū)別在于β2β3環(huán)結(jié)構(gòu)域處多了一小段氨基酸序列,可能會影響其對底物CgHIF-α的結(jié)合。3.闡明長牡蠣HIF-α對PHD的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,CgPHD2A和CgPHD2B蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)中,低氧能夠增加CgPHD2A和CgPHD2B蛋白表達(dá)量,但不影響其亞細(xì)胞定位情況。另外,qRT-PCR分析表明短期低氧能增加CgPHD2A的mRNA表達(dá)量,通過將CgPHD2A基因啟動子區(qū)序列構(gòu)建到熒光素酶報告基因上,結(jié)果顯示CgHIF-α能調(diào)控CgPHD2A的啟動子活性。進(jìn)一步研究表明CgPHD2A基因啟動子區(qū)的-491到-125區(qū)間序列介導(dǎo)CgHIF-α誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。在該區(qū)域中,發(fā)現(xiàn)并證實了一個具有功能活性的低氧反應(yīng)元件HRE;而CgPHD2B只在長期低氧下轉(zhuǎn)錄水平略微升高。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明CgPHD2B不受CgHIF-α轉(zhuǎn)錄調(diào)控。4.分析HIF-α對能量代謝關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,闡明低氧脅迫下的能量代謝機制。低氧初期,牡蠣耗氧率增加,未產(chǎn)生有機酸,表明此時牡蠣行有氧呼吸;隨后,牡蠣耗氧率持續(xù)性降低,琥珀酸、乙酸和丙酸等無氧呼吸終產(chǎn)物相繼產(chǎn)生,表明牡蠣開啟無氧代謝。另外,表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果表明,低氧下糖酵解過程中的絕大部分基因mRNA表達(dá)量下調(diào),但磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK表達(dá)量卻顯著升高。通過PEPCK啟動子序列分析,結(jié)合熒光素酶雙報告基因?qū)嶒炞C實HIF-α能調(diào)控PEPCK的啟動子活性,表明低氧下,HIF-α能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控PEPCK來影響牡蠣能量代謝過程。綜上所述,本文首次研究了軟體動物牡蠣的低氧信號感知及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子作用機制。結(jié)果顯示海洋貝類具有更復(fù)雜的低氧調(diào)控機制,對于解釋潮間帶貝類耐低氧的分子機制有重要意義,也為揭示貝類大規(guī)模死亡提供科學(xué)依據(jù)。同時,牡蠣的研究,能夠在果蠅和線蟲兩種模式生物之間搭建橋梁,為氧分子感受器的系統(tǒng)發(fā)生和演化痕跡的研究提供參考。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1.1 п同氧分壓н的兩種生物耗氧模式（MO2，μmol/min/g）度低氧н兩種生物均維持有氧呼吸，但采用п同形態(tài)生理適應(yīng)機制；嚴(yán)重低氧生物均開啟無氧呼吸（引自 Grieshaber et al.，1994）Fig 1.1 Two modes of oxygen consumption (MO2, μmol/min/g) at different PO2ifferent physiological mechanisms were used to maintain aerobic metabolism betweoxyregulator and oxyconformer during moderate hypoxia, whereas anaerobic procommences under severe hypoxia通常而言，魚類和甲殼動物等具有較高（3-5 mg/L）的亞致死氧臨界致死低氧耐受時間，亦即其低氧耐受性較差；軟體動物的亞致死氧濃g/L），半致死低氧耐受時間長達(dá) 400 h，遠(yuǎn)超其他海洋動物，如牡蠣 20 °C 溫度н半致死低氧耐受時間分別為 47.8，15.9 和 12.2 d （Ka2010）；刺胞動物、環(huán)節(jié)動物和棘皮動物等底棲動物的亞致死濃度低，

圖 1.2 п同海洋生物的低氧耐受性比較左：各類海洋生物的亞致死氧臨界值；右：各類生物的半致死低氧耐受時間。Fish 魚；Crustacea 甲殼類；mollusca 軟體動物；Polychaeta 多毛類；Echinodermata 棘皮動物；Cnidaria 刺胞動物；Annelida 環(huán)節(jié)動物；Priapulida с步蟲）（引自 Vaquer-Sunyer andDuarte，2008）Fig 1.2 The comparison of hypoxia tolerance in different marine animalsLeft: sublethal thresholds of marine animals, Right: median lethal time of marine animalsп論是為了應(yīng)對環(huán)境氧分壓降低或是生物自身需氧量增加所引發(fā)的氧匱乏，海洋動物都進(jìn)化出了 整套完善的行為、生化及分子機制來適應(yīng)低氧。本章節(jié)綜述了海洋貝類常遇到的低氧脅迫及其對應(yīng)的低氧耐受機制。1.2.1 低氧下海洋貝類的生理響應(yīng)機制

圖 1.3 部分磷酸原及其化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1.3 Chemical structures of some phosphagens2）天冬氨酸底物磷酸化。天冬氨酸у糖原發(fā)酵偶聯(lián)。許多海洋無大量的自由氨基酸，其中甘氨酸、D，L-丙氨酸、�；撬帷-天冬酸和 L-谷氨酰胺占據(jù)絕大部分。早在 1973 年，Hochachka and Mu3）提出天冬氨酸和谷氨酸是低氧н能量代謝的底物。在早期無氧代у天冬氨酸底物偶聯(lián)分別生成終產(chǎn)物丙氨酸和琥珀酸。糖原經(jīng)糖酵酮酸，而丙酮酸轉(zhuǎn)移天冬氨酸т的氨基生成丙氨酸，而天冬氨酸的酰乙酸則進(jìn) 步還原為蘋果酸。蘋果酸進(jìn)入線粒體轉(zhuǎn)化為延胡索酸琥珀酸。其中延胡索酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸會產(chǎn)生 ATP，而某些物種中琥轉(zhuǎn)化為丙酸，此過程也會生成 ATP。在早期的無氧代謝中，L-天冬

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