【摘要】：文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是我國沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)貝類,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,深受沿海地區(qū)居民的喜愛。隨著文蛤人工育苗技術(shù)日益成熟,文蛤養(yǎng)殖業(yè)呈快速發(fā)展趨勢(shì),與此同時(shí)產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)良種的需求愈加迫切。由于文蛤遺傳育種研究工作起步不久,需要加強(qiáng)文蛤分子遺傳基礎(chǔ)研究加快功能基因開發(fā)的進(jìn)程和分子育種實(shí)踐。本研究根據(jù)文蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的注釋信息,檢索到了4個(gè)與生長相關(guān)基因的EST片段,包括GRB2、HDAC1、MSTN和α-淀粉酶基因。利用RACE和qRT-PCR技術(shù)對(duì)該4個(gè)基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,在GRB2和HDAC1基因的外顯子區(qū)域篩選與生長相關(guān)的SNP位點(diǎn),并比較分析了α-淀粉酶在四種殼色(暗紋、細(xì)紋、白殼和紅殼)文蛤中的mRNA表達(dá)差異和酶活活力差異,研究它們與生長的密切關(guān)系,篩選可作文蛤良種選育的候選基因,為文蛤分子遺傳育種研究提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:1.利用SMART RACE技術(shù)擴(kuò)增得到了文蛤GRB2(Mm-GRB2)基因的cDNA全長序列,對(duì)其生物信息學(xué)、組織及發(fā)育階段表達(dá)特征進(jìn)行了分析,并利用直接測(cè)序方法在外顯子中篩選SNP位點(diǎn)。結(jié)果顯示,Mm-GRB2基因cDNA全長1 791 bp,開放閱讀框669 bp,編碼223個(gè)氨基酸,蛋白由SH-SH2-SH3 3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成;氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),Mm-GRB2與泥蚶的同源性最高,達(dá)到65.6%,與脊椎動(dòng)物的同源性都在60%以上,說明Mm-GRB2基因在進(jìn)化過程中比較保守。qRT-PCR結(jié)果表明,Mm-GRB2在文蛤6個(gè)組織和10個(gè)發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá),但不同組織間的表達(dá)量并沒有顯著差異;發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),在殼頂幼蟲時(shí)期達(dá)到最高,之后表達(dá)量又有所降低。SNP位點(diǎn)的篩選結(jié)果表明,在Mm-GRB2基因的外顯子區(qū)域共發(fā)現(xiàn)16個(gè)SNP位點(diǎn)。2.獲得了文蛤HDAC1(Mm-HDAC1)基因的cDNA全長序列,該序列長3065bp,開放閱讀框1599bp,編碼532個(gè)氨基酸;氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),文蛤與其他物種同源性為74.3%-78.7%。熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果表明,MmHDAC1基因在文蛤6個(gè)組織中均有表達(dá),其中外套膜中的表達(dá)量相對(duì)最高,并與其他組織間有極顯著差異(p0.01);不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異結(jié)果表明,MmHDAC1基因在殼頂幼蟲期表達(dá)量最高,顯著高于其他發(fā)育時(shí)期(P0.05)。SNP位點(diǎn)篩查結(jié)果表明,在Mm-HDAC1基因的外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了19個(gè)SNP位點(diǎn),其中有3個(gè)SNP位點(diǎn)(627AT、924TC和1266TC)與文蛤生長相關(guān)。3.獲得了文蛤MSTN(Mm-MSTN)基因的cDNA全長序列,序列全長2265bp,開放閱讀框1671bp,編碼557個(gè)氨基酸,具有19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,文蛤與櫛孔扇貝的同源性最高為72%。qRT-PCR結(jié)果表明,MSTN基因在文蛤6個(gè)組織中均有表達(dá),其中閉殼肌中表達(dá)量最高,并與其他組織之間存在顯著差異;不同發(fā)育時(shí)期結(jié)果表明,MSTN在擔(dān)輪幼蟲中表達(dá)量最高,并與其他時(shí)期之間有顯著差異。4.利用SMART RACE技術(shù)擴(kuò)增得到MmAmy的cDNA全長序列,分析了其生物信息學(xué)及時(shí)空表達(dá)特征,并研究了4種殼色花紋(暗紋、細(xì)紋、白殼和紅殼)文蛤MmAmy基因mRNA表達(dá)量和酶活力的差異。結(jié)果表明:(1)MmAmy(登陸號(hào)KP250879)的cDNA全長1783bp,開放閱讀框1566bp,編碼522個(gè)氨基酸,具有19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),文蛤與太平洋牡蠣的同源性最高為73.6%;(2)MmAmy基因組全長6689bp,包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子;(3)qRT-PCR結(jié)果表明,MmAmy基因僅在內(nèi)臟團(tuán)中表達(dá);不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異結(jié)果表明,MmAmy基因在文蛤發(fā)育的未受精卵、受精卵、4細(xì)胞胚胎、囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲前6個(gè)時(shí)期中未檢測(cè)到表達(dá),從D形幼蟲開始檢測(cè)到表達(dá),在殼頂幼蟲時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最高,并與其他時(shí)期有顯著差異(P0.05);(4)4種殼色文蛤內(nèi)臟團(tuán)中MmAmy基因mRNA表達(dá)量和酶活力分析顯示,暗紋文蛤MmAmy基因的表達(dá)量和酶活(4.36±0.78)均最高,紅殼文蛤的MmAmy基因的表達(dá)量和酶活(2.8±0.47)均最低,且二者之間有顯著性差異(P0.05),此結(jié)果又與4種殼色文蛤的生長對(duì)比試驗(yàn)(18月齡)結(jié)果(暗紋文蛤㧐細(xì)紋文蛤㧐白殼文蛤㧐紅殼文蛤)吻合,這表明文蛤α-淀粉酶與其生長、殼色之間存在一定的相關(guān)性,可作為分子育種的重要候選基因。
【學(xué)位授予單位】：浙江萬里學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

果電泳圖（左邊為 3’RACE 產(chǎn)物，右邊為 5’Rphoresis results (left is 3’RACE product, right is cDNA 全長克隆的 cDNA 全長 1 791 bp，開放閱讀框 669 b bp，3’-UTR 為 1 097 bp，包含 1 個(gè)終止密 bp 的 polyA 尾（圖 2-3）。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)ompute 推導(dǎo)出 Mm-GRB2 基因編碼蛋白質(zhì).34。ExPASy Protscale 軟件預(yù)測(cè)顯示，該蛋占比例較高，表現(xiàn)為親水性；SignalP 軟件；TMHMM 軟件預(yù)測(cè)沒有跨膜蛋白。對(duì)文蛤 GRB2 蛋白進(jìn)行了功能域預(yù)測(cè)（圖

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本文編號(hào)：2747478