【摘要】：文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是我國沿海水產養(yǎng)殖的重要經濟貝類,具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值,深受沿海地區(qū)居民的喜愛。隨著文蛤人工育苗技術日益成熟,文蛤養(yǎng)殖業(yè)呈快速發(fā)展趨勢,與此同時產業(yè)發(fā)展對良種的需求愈加迫切。由于文蛤遺傳育種研究工作起步不久,需要加強文蛤分子遺傳基礎研究加快功能基因開發(fā)的進程和分子育種實踐。本研究根據文蛤轉錄組文庫的注釋信息,檢索到了4個與生長相關基因的EST片段,包括GRB2、HDAC1、MSTN和α-淀粉酶基因。利用RACE和qRT-PCR技術對該4個基因進行克隆和表達分析,在GRB2和HDAC1基因的外顯子區(qū)域篩選與生長相關的SNP位點,并比較分析了α-淀粉酶在四種殼色(暗紋、細紋、白殼和紅殼)文蛤中的mRNA表達差異和酶活活力差異,研究它們與生長的密切關系,篩選可作文蛤良種選育的候選基因,為文蛤分子遺傳育種研究提供基礎資料。主要研究結果如下:1.利用SMART RACE技術擴增得到了文蛤GRB2(Mm-GRB2)基因的cDNA全長序列,對其生物信息學、組織及發(fā)育階段表達特征進行了分析,并利用直接測序方法在外顯子中篩選SNP位點。結果顯示,Mm-GRB2基因cDNA全長1 791 bp,開放閱讀框669 bp,編碼223個氨基酸,蛋白由SH-SH2-SH3 3個結構域組成;氨基酸序列比對發(fā)現,Mm-GRB2與泥蚶的同源性最高,達到65.6%,與脊椎動物的同源性都在60%以上,說明Mm-GRB2基因在進化過程中比較保守。qRT-PCR結果表明,Mm-GRB2在文蛤6個組織和10個發(fā)育時期中均有表達,但不同組織間的表達量并沒有顯著差異;發(fā)育時期中的表達量呈現逐漸升高的趨勢,在殼頂幼蟲時期達到最高,之后表達量又有所降低。SNP位點的篩選結果表明,在Mm-GRB2基因的外顯子區(qū)域共發(fā)現16個SNP位點。2.獲得了文蛤HDAC1(Mm-HDAC1)基因的cDNA全長序列,該序列長3065bp,開放閱讀框1599bp,編碼532個氨基酸;氨基酸序列比對發(fā)現,文蛤與其他物種同源性為74.3%-78.7%。熒光定量PCR(qRT-PCR)結果表明,MmHDAC1基因在文蛤6個組織中均有表達,其中外套膜中的表達量相對最高,并與其他組織間有極顯著差異(p0.01);不同發(fā)育時期的表達差異結果表明,MmHDAC1基因在殼頂幼蟲期表達量最高,顯著高于其他發(fā)育時期(P0.05)。SNP位點篩查結果表明,在Mm-HDAC1基因的外顯子區(qū)域發(fā)現了19個SNP位點,其中有3個SNP位點(627AT、924TC和1266TC)與文蛤生長相關。3.獲得了文蛤MSTN(Mm-MSTN)基因的cDNA全長序列,序列全長2265bp,開放閱讀框1671bp,編碼557個氨基酸,具有19個氨基酸組成的信號肽。氨基酸序列比對結果顯示,文蛤與櫛孔扇貝的同源性最高為72%。qRT-PCR結果表明,MSTN基因在文蛤6個組織中均有表達,其中閉殼肌中表達量最高,并與其他組織之間存在顯著差異;不同發(fā)育時期結果表明,MSTN在擔輪幼蟲中表達量最高,并與其他時期之間有顯著差異。4.利用SMART RACE技術擴增得到MmAmy的cDNA全長序列,分析了其生物信息學及時空表達特征,并研究了4種殼色花紋(暗紋、細紋、白殼和紅殼)文蛤MmAmy基因mRNA表達量和酶活力的差異。結果表明:(1)MmAmy(登陸號KP250879)的cDNA全長1783bp,開放閱讀框1566bp,編碼522個氨基酸,具有19個氨基酸組成的信號肽。氨基酸序列比對發(fā)現,文蛤與太平洋牡蠣的同源性最高為73.6%;(2)MmAmy基因組全長6689bp,包括7個外顯子和6個內含子;(3)qRT-PCR結果表明,MmAmy基因僅在內臟團中表達;不同發(fā)育時期的表達差異結果表明,MmAmy基因在文蛤發(fā)育的未受精卵、受精卵、4細胞胚胎、囊胚、原腸胚、擔輪幼蟲前6個時期中未檢測到表達,從D形幼蟲開始檢測到表達,在殼頂幼蟲時期表達量達到最高,并與其他時期有顯著差異(P0.05);(4)4種殼色文蛤內臟團中MmAmy基因mRNA表達量和酶活力分析顯示,暗紋文蛤MmAmy基因的表達量和酶活(4.36±0.78)均最高,紅殼文蛤的MmAmy基因的表達量和酶活(2.8±0.47)均最低,且二者之間有顯著性差異(P0.05),此結果又與4種殼色文蛤的生長對比試驗(18月齡)結果(暗紋文蛤㧐細紋文蛤㧐白殼文蛤㧐紅殼文蛤)吻合,這表明文蛤α-淀粉酶與其生長、殼色之間存在一定的相關性,可作為分子育種的重要候選基因。
【學位授予單位】：浙江萬里學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【圖文】：

果電泳圖（左邊為 3’RACE 產物，右邊為 5’Rphoresis results (left is 3’RACE product, right is cDNA 全長克隆的 cDNA 全長 1 791 bp，開放閱讀框 669 b bp，3’-UTR 為 1 097 bp，包含 1 個終止密 bp 的 polyA 尾（圖 2-3）。結構預測ompute 推導出 Mm-GRB2 基因編碼蛋白質.34。ExPASy Protscale 軟件預測顯示，該蛋占比例較高，表現為親水性；SignalP 軟件；TMHMM 軟件預測沒有跨膜蛋白。對文蛤 GRB2 蛋白進行了功能域預測（圖

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