【摘要】：棕櫚油,產(chǎn)量僅次于大豆油,已廣泛應(yīng)用于魚類飼料中。棕櫚油富含棕櫚酸,而細(xì)胞內(nèi)過量的棕櫚酸積累會引起細(xì)胞功能紊亂或者細(xì)胞死亡,即脂毒性。在哺乳動物細(xì)胞模型中,高濃度棕櫚酸(250-500μM)會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡,然而棕櫚酸脂毒性在暖水魚活體及細(xì)胞水平上還未見報道。本研究的第一部分利用斑馬魚建立暖水魚的棕櫚酸養(yǎng)殖模型,向斑馬魚投喂低脂(LF),高脂(HF)以及3種添加了棕櫚酸的高脂飼料(PA4%,PA8%,PA12%),飼喂2周檢測肝臟棕櫚酸積累情況,飼喂4周檢測血清ALT、血清AST、肝臟ALT、肝臟AST、肝臟caspase-3以及Trx和Saa2 mRNA水平,作為肝臟損傷指標(biāo);檢測Grp78和Chop mRNA水平,并且通過免疫組化檢測肝臟GRP78和CHOP蛋白水平,作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果顯示,肝臟棕櫚酸含量隨飼料中含量的升高而升高;與HF組相比,PA8%和PA12%組血清ALT水平分別升高了40.7%和59.5%,血清AST水平分別升高了28.8%和28.0%;與HF組相比,PA12%組Grp78和Chop mRNA分別增加至2.2和2.7倍,食源性棕櫚酸誘導(dǎo)斑馬魚肝臟損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究第二部建立棕櫚酸-細(xì)胞模型,研究暖水魚肝臟對棕櫚酸脂毒性的反應(yīng)機(jī)制。該部分利用RTCA實時監(jiān)控系統(tǒng),Alarmablue活性檢測試劑檢測斑馬魚肝臟細(xì)胞活性,利用流式細(xì)胞儀檢測棕櫚酸對斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡的影響,利用qPCR檢測未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)通路激活情況,并且用特異性抑制劑阻斷通路激活,驗證該通路與棕櫚酸脂毒性的聯(lián)系。結(jié)果表明,與對照組相比,棕櫚酸抑制斑馬魚肝臟細(xì)胞活性,誘導(dǎo)斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡,且未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)感應(yīng)因子Grp78和Grp94 mRNA均受到棕櫚酸顯著性上調(diào)。阻斷PERK-CHOP和IRE1α-JNK通路緩解棕櫚酸誘導(dǎo)的凋亡,阻斷ATF6通路加劇棕櫚酸誘導(dǎo)的凋亡。該部分結(jié)果表明,PERK-CHOP和IRE1α-JNK通路參與棕櫚酸對斑馬魚肝臟細(xì)胞的脂毒性。本研究第三部分利用斑馬魚幼魚驗證棕櫚酸對斑馬魚肝臟的脂毒性反應(yīng)通路,向5-dpf幼魚投喂LF,HF,PA8%飼料,投喂1周,利用qPCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)情況及未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)通路,并且根據(jù)檢測結(jié)果選擇特異性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑阻斷PERK-CHOP和ATF6通路。結(jié)果顯示,與HF組相比,PA8%組幼魚的Trx和Saa2均受到顯著性上調(diào),Grp78、Grp94、Perk、Chop mRNA水平均較HF顯著升高,PA8%組幼魚自噬基因Bec1、Atg4b、Atg9a mRNA水平也受到上調(diào);抑制劑試驗結(jié)果表明,與對照組(DMSO)相比,salubrinal有效抑制PA8%組幼魚PERK-CHOP通路基因表達(dá),AEBSF有效抑制ATF6通路基因表達(dá),salubrinal同時還下調(diào)了PA8%組幼魚自噬基因Bec1、Atg4b、Atg9a,肝臟損傷基因Saa2 mRNA水平。該部分結(jié)果表明,食源性棕櫚酸通過PERK-CHOP促凋亡通路誘導(dǎo)肝臟損傷。通過研究食源性棕櫚酸對斑馬魚肝臟的負(fù)面影響,我們發(fā)現(xiàn)棕櫚酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的促凋亡通路誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞損傷,也闡明了棕櫚油中的高棕櫚酸含量會成為棕櫚油在暖水魚養(yǎng)殖中應(yīng)用的限制性因素。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S963
【圖文】：

圖 2.1 飼料棕櫚酸濃度與肝臟棕櫚酸濃度的關(guān)系Fig 2.1 Relationship of dietary and liver PAlevels圖 2.2 肝臟 TAG 水平ig 2.2 Hepatic TAG levels of zebrafish fed different d斑馬魚肝臟損傷和 PA12%組的血清 ALT 水平分別增加了 4PA8%和 PA12%組的血清 AST 水平分別增3B）；與 HF 組相比，PA8%和 PA12%組的

圖 2.2 肝臟 TAG 水平 Hepatic TAG levels of zebrafish fed differ馬魚肝臟損傷A12%組的血清 ALT 水平分別增加8%和 PA12%組的血清 AST 水平分；與 HF 組相比，PA8%和 PA12%=0.006）（圖 2.3C），AST 水平無臟 caspase-3 活性沒有顯著性差異68）（圖 2.3E）。與 HF 組相比，P（P=0.068，P=0.088）；PA12%組上調(diào) 2 倍（P=0.022）（圖 2.3F,

A 血清 ALT 水平；B 血清 AST 水平；C 肝臟 ALT 水平；D 肝臟 AST 水平；E 肝臟 caspase-3 活性；F 肝臟 TrxmRNA 相對表達(dá)水平；G 肝臟 Saa2 mRNA 相對表達(dá)水平圖 2.3 食源性棕櫚酸誘導(dǎo)斑馬魚肝臟損傷Fig 2.3 Dietary PAinduced liver damage in zebrafish2.4.3 食源性棕櫚酸誘導(dǎo)斑馬魚肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與 HF 組相比，PA8%組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感應(yīng)蛋白的編碼基因 Grp78 mRNA 表現(xiàn)出上調(diào)趨勢（P=0.092），PA12%組的 Grp78 mRNA 上調(diào)至 2.2 倍（P=0.015）（圖 2.4A）；PA4%、8%、12%組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因 Chop mRNA 均顯示上調(diào)，且與 HF 組差異顯著（P=0.041，P=0.007，P=0.003）（圖 2.4B）。免疫組化結(jié)果表明，隨著食源性棕櫚酸的添加，肝臟 GRP78 和 CHOP 蛋白表達(dá)水平也隨之增加（圖 2.4C）。15

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 方芳;龔平生;宋祥福;龔守良;王志成;;低劑量電離輻射誘導(dǎo)小鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK-CHOP信號通路的激活[J];中華男科學(xué)雜志;2012年09期

本文編號：2746005