【摘要】：水產動物疾病防控一直是漁業(yè)生產關注的焦點�？股厥羌毦约膊》揽氐挠行幬�,但長時間使用,會使病原體產生耐藥性。因此,篩選抗生素替代品,有效控制細菌性疾病是疾病防控的重要內容�？咕氖且活惥哂锌咕钚缘年栯x子多肽,可有效殺滅細菌,避免產生耐藥性,具有替代抗生素的潛在價值。本研究通過克隆淇河鯽(Carassius auratus)組蛋白H2B基因的全長序列,并提取HLP 1對應的編碼區(qū)N端部分序列,對其分子特征進行分析;采用熒光定量PCR方法,對H2B組織表達及對嗜水氣單胞菌的響應進行研究;對HLP 1原核重組表達和人工合成HLP 1的抑菌活性進行研究。基于叉尾洶(Letalurus punetaus)編碼區(qū)保守序列設計引物。從淇河鯽鰓、腎、脾和肝中提取總RNA,通過RT-PCR技術獲得c DNA第一鏈作為模板,擴增出淇河鯽H2B基因中間片段,將片段連接到p MD 19-T載體,轉化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,克隆測序獲得H2B中間片段長375 bp。根據已獲得H2B中間片段,分別設計一組用于3?UTR和5?UTR擴增的特異性引物,通過巢式PCR方法分別擴增出3?UTR 410 bp和5?UTR 32bp的片段,拼接得到淇河鯽組蛋白H2B基因全長817 bp。ORF Finder預測組蛋白H2B ORF長375 bp,編碼134個氨基酸。在線軟件預測組蛋白H2B分子量為13.61 k Da,等電點PI值為10.37,帶有18個正電荷,為不穩(wěn)定蛋白質。組蛋白H2B二級結構中含較多α螺旋和無規(guī)則卷曲,少量β折疊和延伸鏈。使用Bio Edit分析包括親緣關系較遠的斑馬紋草雀(Taeniopygia guttata)在內的14個物種的H2B編碼區(qū)序列發(fā)現,它們和淇河鯽的同源性都在75%以上,其中與斑馬魚((Danio rerio)同源性更是高達90.7%。HLP 1是組蛋白H2B N末端21個氨基酸組成的多肽,含有豐富的堿性氨基酸。根據組蛋白H2B序列設計特異性引物擴增出HLP 1,并成功構建重組表達質粒PET-32a-HLP 1,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3),篩選出陽性菌落加入到含AMP的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600nm在0.6-0.8之間,經IPTG誘導培養(yǎng)后沉淀、洗滌、裂解菌體,收集裂解液,然后通過SDS-PAGE凝膠電泳,成功檢測出融合蛋白。采用RT-q PCR方法檢測了淇河鯽組蛋白H2B及HLP 1基因在鰓、腎臟、脾臟、肝臟和頭腎中的表達,正常情況下組蛋白H2B m RNA在肝臟中表達量最高,腎臟和頭腎次之,在鰓和脾臟中表達量較少,HLP1在頭腎中表達量最高,肝臟次之,其余組織中的表達水平和H2B相似。魚體注射嗜水氣單胞菌后48 h內,H2B和HLP 1 m RNA表達量在各組織中明顯上調。人工合成淇河鯽多肽HLP 1,將HLP 1以2倍濃度梯度稀釋為200μg/m L、100μg/m L、50μg/m L和25μg/m L,隨著HLP 1濃度的升高,抑菌圈直徑逐漸擴大,且25 ug/ml HLP 1即能達到100mg/m L氨芐的抗菌水平,說明HLP 1抗菌活性很高,其在水生動物特別是魚類抗病和免疫中能起到重要作用。
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【圖文】：

、腎、脾中提取總 RNA，使用 1.5%瓊脂糖凝膠s 比較亮，5 s 比較弱（圖 2-1），說明 RNA 提取果顯示鰓、腎、脾的質量濃度分別為 1021 ng/μL/280nm都在 1.8-2.0 之間。

組蛋白H2B的5RACE克隆和3RACE克隆

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 林鑫;毛述宏;楊陽;林仕梅;羅琳;;飼料中添加抗菌肽對錦鯉生長、非特異性免疫力和抗病力的影響[J];動物營養(yǎng)學報;2013年08期

2 王冬冬;;抗菌肽在水產動物的研究現狀及發(fā)展前景[J];飼料與畜牧;2012年04期

3 周興旺;張志輝;孟云;;抗菌肽S807對水產動物的生物活性研究[J];水產養(yǎng)殖;2011年10期

4 王四新;季海峰;劉輝;張董燕;單達聰;王雅民;宋青龍;;抗菌肽對草魚生長性能的影響[J];飼料研究;2011年04期

5 郝剛;施用暉;唐亞麗;樂國偉;;抗菌肽BuforinⅡ衍生物與大腸桿菌基因組DNA的作用機制[J];微生物學報;2010年03期

6 馮澤猛;唐志如;黃瑞林;印遇龍;;抗菌肽buforinⅡ的研究進展[J];中國抗生素雜志;2009年11期

7 陳凌昊;周浪;許娜;;陽離子抗菌肽抗腫瘤的作用機制[J];吉林醫(yī)藥學院學報;2009年05期

8 池磊;劉揚;馮琳;周小秋;;魚類組蛋白衍生抗菌肽與其抗菌的關系[J];飼料工業(yè);2009年06期

9 侯利霞;翟培;施用暉;唐亞莉;樂國偉;;家蠅抗菌肽對細菌細胞表面特性影響及其作用機理的研究[J];微生物學通報;2007年03期

10 黃文樹;李少菁;蔡靈;楊明;陳君慧;王克堅;;尼羅羅非魚Hepcidin基因結構與序列分析[J];廈門大學學報(自然科學版);2007年03期

本文編號：2742861