【摘要】：水產(chǎn)動物疾病防控一直是漁業(yè)生產(chǎn)關(guān)注的焦點(diǎn)�？股厥羌�(xì)菌性疾病防控的有效藥物,但長時(shí)間使用,會使病原體產(chǎn)生耐藥性。因此,篩選抗生素替代品,有效控制細(xì)菌性疾病是疾病防控的重要內(nèi)容。抗菌肽是一類具有抗菌活性的陽離子多肽,可有效殺滅細(xì)菌,避免產(chǎn)生耐藥性,具有替代抗生素的潛在價(jià)值。本研究通過克隆淇河鯽(Carassius auratus)組蛋白H2B基因的全長序列,并提取HLP 1對應(yīng)的編碼區(qū)N端部分序列,對其分子特征進(jìn)行分析;采用熒光定量PCR方法,對H2B組織表達(dá)及對嗜水氣單胞菌的響應(yīng)進(jìn)行研究;對HLP 1原核重組表達(dá)和人工合成HLP 1的抑菌活性進(jìn)行研究。基于叉尾洶(Letalurus punetaus)編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物。從淇河鯽鰓、腎、脾和肝中提取總RNA,通過RT-PCR技術(shù)獲得c DNA第一鏈作為模板,擴(kuò)增出淇河鯽H2B基因中間片段,將片段連接到p MD 19-T載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,克隆測序獲得H2B中間片段長375 bp。根據(jù)已獲得H2B中間片段,分別設(shè)計(jì)一組用于3?UTR和5?UTR擴(kuò)增的特異性引物,通過巢式PCR方法分別擴(kuò)增出3?UTR 410 bp和5?UTR 32bp的片段,拼接得到淇河鯽組蛋白H2B基因全長817 bp。ORF Finder預(yù)測組蛋白H2B ORF長375 bp,編碼134個(gè)氨基酸。在線軟件預(yù)測組蛋白H2B分子量為13.61 k Da,等電點(diǎn)PI值為10.37,帶有18個(gè)正電荷,為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。組蛋白H2B二級結(jié)構(gòu)中含較多α螺旋和無規(guī)則卷曲,少量β折疊和延伸鏈。使用Bio Edit分析包括親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的斑馬紋草雀(Taeniopygia guttata)在內(nèi)的14個(gè)物種的H2B編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn),它們和淇河鯽的同源性都在75%以上,其中與斑馬魚((Danio rerio)同源性更是高達(dá)90.7%。HLP 1是組蛋白H2B N末端21個(gè)氨基酸組成的多肽,含有豐富的堿性氨基酸。根據(jù)組蛋白H2B序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增出HLP 1,并成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET-32a-HLP 1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),篩選出陽性菌落加入到含AMP的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600nm在0.6-0.8之間,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后沉淀、洗滌、裂解菌體,收集裂解液,然后通過SDS-PAGE凝膠電泳,成功檢測出融合蛋白。采用RT-q PCR方法檢測了淇河鯽組蛋白H2B及HLP 1基因在鰓、腎臟、脾臟、肝臟和頭腎中的表達(dá),正常情況下組蛋白H2B m RNA在肝臟中表達(dá)量最高,腎臟和頭腎次之,在鰓和脾臟中表達(dá)量較少,HLP1在頭腎中表達(dá)量最高,肝臟次之,其余組織中的表達(dá)水平和H2B相似。魚體注射嗜水氣單胞菌后48 h內(nèi),H2B和HLP 1 m RNA表達(dá)量在各組織中明顯上調(diào)。人工合成淇河鯽多肽HLP 1,將HLP 1以2倍濃度梯度稀釋為200μg/m L、100μg/m L、50μg/m L和25μg/m L,隨著HLP 1濃度的升高,抑菌圈直徑逐漸擴(kuò)大,且25 ug/ml HLP 1即能達(dá)到100mg/m L氨芐的抗菌水平,說明HLP 1抗菌活性很高,其在水生動物特別是魚類抗病和免疫中能起到重要作用。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【圖文】：

、腎、脾中提取總 RNA，使用 1.5%瓊脂糖凝膠s 比較亮，5 s 比較弱（圖 2-1），說明 RNA 提取果顯示鰓、腎、脾的質(zhì)量濃度分別為 1021 ng/μL/280nm都在 1.8-2.0 之間。

組蛋白H2B的5RACE克隆和3RACE克隆

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 林鑫;毛述宏;楊陽;林仕梅;羅琳;;飼料中添加抗菌肽對錦鯉生長、非特異性免疫力和抗病力的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年08期

2 王冬冬;;抗菌肽在水產(chǎn)動物的研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J];飼料與畜牧;2012年04期

3 周興旺;張志輝;孟云;;抗菌肽S807對水產(chǎn)動物的生物活性研究[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2011年10期

4 王四新;季海峰;劉輝;張董燕;單達(dá)聰;王雅民;宋青龍;;抗菌肽對草魚生長性能的影響[J];飼料研究;2011年04期

5 郝剛;施用暉;唐亞麗;樂國偉;;抗菌肽BuforinⅡ衍生物與大腸桿菌基因組DNA的作用機(jī)制[J];微生物學(xué)報(bào);2010年03期

6 馮澤猛;唐志如;黃瑞林;印遇龍;;抗菌肽buforinⅡ的研究進(jìn)展[J];中國抗生素雜志;2009年11期

7 陳凌昊;周浪;許娜;;陽離子抗菌肽抗腫瘤的作用機(jī)制[J];吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào);2009年05期

8 池磊;劉揚(yáng);馮琳;周小秋;;魚類組蛋白衍生抗菌肽與其抗菌的關(guān)系[J];飼料工業(yè);2009年06期

9 侯利霞;翟培;施用暉;唐亞莉;樂國偉;;家蠅抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞表面特性影響及其作用機(jī)理的研究[J];微生物學(xué)通報(bào);2007年03期

10 黃文樹;李少菁;蔡靈;楊明;陳君慧;王克堅(jiān);;尼羅羅非魚Hepcidin基因結(jié)構(gòu)與序列分析[J];廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年03期

本文編號：2742861