【摘要】：奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus),屬于鱸形目(Perciformes),麗魚科(Cichlids),口孵非鯽屬(Oreochromis)。羅非魚由于其肉質(zhì)鮮美且無肌間刺,一直以來廣受消費者的喜愛。據(jù)FAO統(tǒng)計羅非魚已經(jīng)成為世界上第二大養(yǎng)殖魚類,中國是世界上羅非魚最大的生產(chǎn)國和出口國�？诜醴泅a屬中有將近70種,但是只有尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)、莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)和奧利亞羅非魚以及其雜交品種廣泛應(yīng)用于漁業(yè)生產(chǎn)。由于羅非魚生長具有顯著的性別二態(tài)性,雄魚比雌魚生長快,因此在生產(chǎn)上更傾向于生產(chǎn)全雄羅非魚。傳統(tǒng)的全雄羅非魚生產(chǎn)途徑有激素處理和雜交。然而激素處理會造成環(huán)境的極大污染,且激素殘留造成的食品安全問題也日益突出。雜交育種常用的是尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚進行雜交,由于缺少準確的分子標(biāo)記只能依靠測交來鑒定親本基因型,費時費力,成本高昂。目前生產(chǎn)上僅尼羅羅非魚具有可以準確鑒定其遺傳性別的分子標(biāo)記并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn),對于奧利亞羅非魚雖然有個別有關(guān)性別連鎖分子標(biāo)記的報道,但幾乎沒有可以廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的分子標(biāo)記。因此開發(fā)奧利亞羅非魚性別特異分子標(biāo)記對于生產(chǎn)全雄羅非魚具有重要的意義。另一方面,奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚作為近緣種,基因組相似度高達95%以上,卻擁有完全不同的性染色體和性別決定系統(tǒng)。尼羅羅非魚性別決定系統(tǒng)為雄性異配的XX/XY型,而奧利亞羅非魚為雌性異配的ZZ/ZW型。尼羅羅非魚的性染色體是LG(linkage group)23,在一些品系中也有報道認為其性染色體為LG1。奧利亞羅非魚在LG3上具有一個的雌性性別決定位點,在LG1上具有一個雄性性別決定位點,且雌性位點上位作用于雄性位點。研究奧利亞羅非魚性別連鎖的分子標(biāo)記及性別決定基因有助于深入解析麗魚科魚類的快速成種及適應(yīng)性輻射等進化生物學(xué)問題。本研究構(gòu)建了一個奧利亞羅非魚的家系,為后續(xù)研究提供充足的實驗材料。通過對F2代群體93條個體和兩個親本利用SLAF測序進一步證實奧利亞羅非魚的性染色體位于LG3,鎖定了性別決定候選區(qū)間。結(jié)合實驗室前期對奧利亞羅非魚ZZ和WW個體基因組重測序,在性別決定候選區(qū)間內(nèi)部篩選ZZ和WW基因組序列差異較大的結(jié)構(gòu)變異(例如插入、缺失)設(shè)計引物進行PCR擴增,篩選出5對與性別連鎖的分子標(biāo)記。通過對236尾F2代個體進行驗證,計算吻合率,進一步確定性別決定區(qū)間。另外,補充和完善了分子標(biāo)記輔助育種生產(chǎn)全雄羅非魚的方案。具體結(jié)果如下:1.構(gòu)建了奧利亞羅非魚的家系。利用ZZ雄魚(編號為67958)和ZW雌魚(編號為67013)兩個親魚交配,得到F1代個體,并采取了三種繁殖方案獲得F2代群體。第一種方案是將ZW雌魚和經(jīng)芳香化酶抑制劑Fetrozole處理性逆轉(zhuǎn)的ZW假雄魚繁殖,得到93尾F2代群體,雌雄比例為3:1,基因型比為1(WW):2(ZW):1(ZZ)的后代,該群體主要用于SLAF測序。第二種是將ZZ雄魚和ZW雌魚進行繁殖,得到103尾F2代群體,雌雄比例為1(ZW):1(ZZ),該群體主要用來驗證分子標(biāo)記,構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。第三種組合是將WW超雌魚與性逆轉(zhuǎn)的ZW假雄魚繁殖,得到40條后代,全為雌魚且基因型比例為1(ZW):1(WW),該組合主要目的是構(gòu)建WW維持系,獲得大量的WW后代。2.通過SLAF測序數(shù)據(jù)鎖定性染色體和性別決定區(qū)間。利用奧利亞羅非魚93尾F2代個體及其親本進行SLAF測序,共得到499.59 Mreads數(shù)據(jù),開發(fā)得到822,487個SLAF標(biāo)簽,其中多態(tài)性標(biāo)簽230,795個。共有以下8種類型:ab×cd,ef×eg,hk×hk,lm×ll,nn×np,aa×bb,ab×cc和cc×ab。對本實驗來說,因為親本的基因型為ZW×ZW,因此選擇hk?×?hk多態(tài)性標(biāo)簽作為適合群體的有效標(biāo)簽,一共有14,458個。通過對性別決定區(qū)間進行QTL定位,將其性別決定區(qū)間鎖定在LG3b染色體,具體區(qū)間為0 7,319,395之間,約7.3Mb。3.篩選性別連鎖分子標(biāo)記。結(jié)合本實驗室前期對奧利亞羅非魚ZZ和WW個體基因組重測序的分析結(jié)果,在SLAF測序得到的性別決定區(qū)間內(nèi)ZZ和WW基因組序列存在結(jié)構(gòu)差異的位置設(shè)計引物,進行PCR擴增驗證。從200對引物中篩選得到了5個與性別連鎖的分子標(biāo)記,分別命名Marker1-5。其中Marker-1和Marker-2可以準確區(qū)分ZZ,ZW和WW三種基因型,Marker-3、Marker-4和Marker-5可以區(qū)分ZZ和ZW,但無法區(qū)分ZW和WW兩種基因型。將上述分子標(biāo)記分別在236個個體中進行PCR擴增驗證,發(fā)現(xiàn)Marker-1和Marker-2與在所有個體中均與性別完全連鎖,而Marker-3,4,5均存在基因型和性別表型不一致的情況,Marker-3和Marker-4有一條不吻合,Marker-5有兩條不吻合。4.收窄性別決定區(qū)間,尋找性別決定候選基因。根據(jù)5個與性別連鎖分子標(biāo)記在性別決定區(qū)間中的位置關(guān)系,以2017年NCBI公布的尼羅羅非魚基因組為參考,畫出分子標(biāo)記在奧利亞羅非魚LG3染色體中的位置示意圖。性別決定區(qū)間位于LG3b上0-3,649,243之間,將性別決定區(qū)間收窄至3.6Mb。統(tǒng)計分子標(biāo)記在103尾F2代個體中與性別的吻合率,利用JoinMap4.0構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。Marker-1和Marker-2與的吻合率為100%,與性別完全吻合。Marker-3與Marker-4的吻合率為99.0%,與性別之間的遺傳距離為1cM(厘摩),Marker-5的吻合率為98.0%,與性別之間的遺傳距離為2cM。5.完善了分子標(biāo)記輔助育種生產(chǎn)WW超雌魚方案。利用篩選得到的可以準確區(qū)分ZZ,ZW和WW基因型的分子標(biāo)記Marker-1和Marker-2,可以獲得大量的WW超雌魚,完善了基因型為WY的遺傳全雄羅非魚分子標(biāo)記輔助育種具體實施方案。1)通過芳香化酶抑制劑(Fadrozole)處理ZZ(♂)×ZW(♀)后代,分子標(biāo)記篩選出ZW(♂)雄魚。2)利用分子標(biāo)記篩選ZW(♀)×ZW(♂)繁殖后代,可以得到WW(♀)超雌魚。3)通過WW(♀)×YY(♂)雜交可以得到大量全雄WY奧尼雜交魚。4)也可利用WW(♀)×ZW(♂)可以建立WW超雌魚的維持系,獲得更多的WW個體用于生產(chǎn)。至此,我們可得利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)生產(chǎn)所有的雜交基因型的羅非魚例如ZX、ZY、WX和WY,可用于生產(chǎn)和性染色體轉(zhuǎn)化及進化等方面的研究。綜上所述,本研究構(gòu)建了奧利亞羅非魚的家系,篩選出了5個性別連鎖的分子標(biāo)記,補充和完善了全雄羅非魚的分子標(biāo)記輔助育種生產(chǎn)體系。將奧利亞羅非魚的性別決定區(qū)間收窄至3.6Mb。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q953;S917.4
【圖文】：

看其是否基于 PCR 技術(shù)可以分為兩大類（圖1），除了 RFLP 標(biāo)記，其他分子標(biāo)記均基于 PCR 技術(shù)發(fā)展而來(Maqsood andAhmad, 2017)。圖 1 水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類中常用的分子標(biāo)記Figure 1 Molecular markers used in aquaculture2.1 RFLP 標(biāo)記RFLP 標(biāo)記（Restriction Fragment Length Polymorphism）即限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記，是發(fā)展最早的 DNA 標(biāo)記技術(shù) (Tanksley et al., 1989)。該技術(shù)的原理是利用限制性內(nèi)切酶對 DNA 進行酶切，利用酶切位點上堿基的變化（如插入、缺失、重排或突變）得到長短不一的 DNA 片段，從而得到不同種群或者不同個體間 DNA 差異片段。RFLP 標(biāo)記的優(yōu)勢包括相對較高的多態(tài)性、共顯性遺傳和高重復(fù)性。但 RFLP 實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，不適于大規(guī)模的分子育種

圖 2 利用醋酸洋紅染色法鑒定奧利亞羅非魚表型性別。A 圖為精巢，B 圖為卵巢。Figure 2 Phenotypic sex of blue tilapia fry using the aceto-carmine technique. A: testis; B: ovary.2.4 SLAF 文庫構(gòu)建與測序該部分內(nèi)容主要由北京百邁克生物技術(shù)有限公司完成，首先選定最適合的酶切方案，對樣品基因組 DNA 進行酶切，對得到的酶切片段進行 3’ 端加 A 處理，連接測序接頭，PCR 擴增，混樣，切膠選取目的片段，文庫檢驗合格后用 IlluminaHiSeq 2500 進行測序（圖 3）。主要實驗步驟如下：

【參考文獻】

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本文編號：2742669