【摘要】：嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種廣泛分布在各種水體中的革蘭氏陰性菌,也是一種典型的原發(fā)性條件致病菌。隨著近年來(lái)漁業(yè)的不斷發(fā)展,因嗜水氣單胞菌感染而引起的魚類傳染病造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,為此,對(duì)該菌致病機(jī)制開展相關(guān)研究,有助于防控魚類病原體并大力發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)是細(xì)菌通過(guò)信號(hào)分子分泌、識(shí)別,從而調(diào)控基因水平轉(zhuǎn)移、毒力因子分泌、芽孢產(chǎn)生及生物膜形成等群體行為的一種細(xì)胞通訊機(jī)制,這些功能對(duì)細(xì)菌的侵襲、定殖、增殖等致病過(guò)程起著重要作用。AhyI(autoinducer synthesis protein,AhyI))是嗜水氣單胞菌QS系統(tǒng)LuxI蛋白家族中,能夠催化自身產(chǎn)生一種具有誘導(dǎo)功能的分子合成酶;此外,AhyI還可以調(diào)控嗜水氣單胞菌生物被膜的形成、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶等的生物活性,由此可以看出,該蛋白在維持細(xì)菌基本生理功能中起重要作用。另一方面,蛋白翻譯后修飾(protein post-translational modification,PTM)是在蛋白質(zhì)水平對(duì)目的蛋白進(jìn)行可逆地化學(xué)修飾,使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜、功能更為完善、調(diào)節(jié)更為精細(xì)、作用更為專一,因此PTM成為當(dāng)前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。因此,掌握靶蛋白PTM的相關(guān)信息有助于更好地了解疾病狀態(tài)和其它生命現(xiàn)象。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌AhyI蛋白在K7位點(diǎn)具有乙�；揎�,但其生物學(xué)功能尚不清楚。為了研究AhyI蛋白及其乙�；揎棇�(duì)嗜水氣單胞菌生理功能的影響,本研究采用同源重組技術(shù),首先構(gòu)建了?ahyI缺失菌株,再利用基因補(bǔ)回與點(diǎn)突變技術(shù)手段,構(gòu)建ahyI回復(fù)株與該基因K7位點(diǎn)突變株模擬K7位點(diǎn)乙�；揎�,并對(duì)ahyI系列菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析;同時(shí)提取了該菌株的信號(hào)分子,進(jìn)而研究AhyI蛋白的缺失及其乙�；揎棇�(duì)群體感應(yīng)的影響。本論文研究結(jié)果如下:1、通過(guò)同源重組方法,成功構(gòu)建了ahyI基因缺失株;根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,進(jìn)而構(gòu)建嗜水氣單胞菌ΔahyI的回復(fù)株?ahyI::ahyI、空載株?ahyI::Vector以及K7Q、K7R的定點(diǎn)突變株?ahyI::ahyI-K7Q、?ahyI::ahyI-K7R。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AhyI K7Q和K7R位點(diǎn)突變后會(huì)降低嗜水氣單胞菌蛋白的乙�；揎�,且K7Q位點(diǎn)突變后對(duì)菌株生理功能的影響更顯著。2、提取嗜水氣單胞菌ATCC7966 ahyI的基因敲除株、回復(fù)株、K7Q與K7R點(diǎn)突變株的信號(hào)分子,通過(guò)薄膜層析色譜(TCL)與E.coli pSB536發(fā)光實(shí)驗(yàn)研究AhyI對(duì)于A.hydrophila信號(hào)分子產(chǎn)生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌K7Q點(diǎn)突變后,其減少AI-1信號(hào)分子的分泌,提示AhyI蛋白乙�；揎椩谛盘�(hào)分子產(chǎn)生中具有重要的調(diào)節(jié)作用。3、通過(guò)胞外蛋白酶活分析和溶血性分析等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),?ahyI可在一定程度上影響A.hydrophila毒力因子的分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明嗜水氣單胞菌基因敲除株?ahyI能顯著增強(qiáng)細(xì)菌溶血能力,并抑制胞外蛋白酶活性;而AhyI蛋K7Q和K7R位點(diǎn)突變與回復(fù)株相比無(wú)明顯變化,說(shuō)明K7乙�；揎棇�(duì)A.hydrophila的兩種生理活性無(wú)顯著影響。4、測(cè)定嗜水氣單胞菌ahyI的缺失株、回復(fù)株和點(diǎn)突變株與野生株的生長(zhǎng)曲線與生物膜形成,結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生株與ahyI缺失株、回復(fù)株和點(diǎn)突變株相比,它們的生長(zhǎng)狀況幾乎沒(méi)有差異,其生物膜的形成也不受缺失株影響,說(shuō)明ahyI基因?qū)κ人畾鈫伟纳L(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有明顯影響。綜上所述,通過(guò)對(duì)嗜水氣單胞菌ahyI缺失與系列點(diǎn)突變菌株的生理表型研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AhyI蛋白可通過(guò)K7位點(diǎn)的乙�；揎椪{(diào)控AI-1型信號(hào)分子的分泌,但對(duì)其它的生理功能沒(méi)有明顯的影響。以上研究結(jié)果為深入研究AhyI蛋白翻譯后修飾在維持細(xì)菌重要生物學(xué)功能的作用方面提供了理論依據(jù),進(jìn)而為系統(tǒng)研究嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S941.42
【圖文】：

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文12圖2-1 三種質(zhì)粒圖譜(A) pET-32a 質(zhì)粒圖譜; (B) pRE-112 質(zhì)粒圖譜; (C) pBBR1-MCS1 質(zhì)粒圖譜.Fig.2-1 Three plasmid profiles(B) pET-32a plasmid profile; (B) pRE-112 plasmid profiles; (C) pBBR1-MCS1 plasmidprofiles.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑凝膠DNA?

因ahyI 上下游約為500 bp的片段；然后，通過(guò)CE Design V1.03軟件分別設(shè)計(jì)上游片段兩端引物F1F2、下游片段兩端引物F3F4 ，同時(shí)分別在F1上游前100 bp與F4下游100 bp設(shè)計(jì)引物F7F8，如圖2-2所示。再通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因上游片段與下游片段，擴(kuò)增產(chǎn)物回收備用。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王建華;權(quán)春善;李新;;細(xì)菌群體感應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其對(duì)抗生素生產(chǎn)的影響[J];中國(guó)生物工程雜志;2008年04期

2 陳翠珍,張曉君,房海,何振平,王秀云,鞏元芳;魚氣單胞菌感染癥及其病原的檢驗(yàn)與分析[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2000年S1期

3 儲(chǔ)衛(wèi)華,陸承平;嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶對(duì)鯽魚的致病性[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 姚倫;團(tuán)頭魴暴發(fā)性敗血癥病原和免疫防治研究[D];南昌大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2742423