【摘要】：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,p),是弧菌科(Vibrio)弧菌屬的桿菌或多形態(tài)的革蘭氏陰性菌,具嗜鹽性,廣泛存在于海洋以及河口環(huán)境,通過食品傳播,是遍布世界的食源性致病菌,人多因食用被本菌污染的生的或未煮熟的海鮮而引起急性胃腸炎發(fā)生食物中毒。我國每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的報道,且在食源性致病引發(fā)的食物中毒病例中占首要位置,快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查有助于該病的控制。傳統(tǒng)檢測方法存在操作繁瑣、檢測周期長、成本高等問題,促使以檢測特異靶基因為目標(biāo)的分子檢測技術(shù)快速發(fā)展。目前PCR檢測方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假陽性和漏檢的風(fēng)險,建立敏感而特異的快速分子檢測方法迫在眉睫。本文在對toxRS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及同源性分析的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)toxR、toxS均有作為種特異性檢測靶基因的可能,故分別設(shè)計引物primers-R、primers-S及primers-R-S,優(yōu)化PCR反應(yīng)條件建立相應(yīng)PCR方法,通過對57株副溶血性弧菌和19株親緣相近菌及食源性致病菌的檢測,toxR-S PCR顯示出較好的穩(wěn)定性和特異性,檢測極限達(dá)2pg基因組DNA。toxR-S PCR方法進(jìn)一步與國標(biāo)方法對比驗證,通過對359份市場海產(chǎn)品檢測,符合率高達(dá)95.82%,敏感性100%,特異性92.39%。對兩種方法檢測陽性差異的15份樣品,以其總細(xì)菌DNA為模板擴(kuò)增副溶血性弧菌看家基因,測序比對顯示與副溶血性弧菌同源性高達(dá)97%以上。表明所建立的方法具有快速、特異、敏感等優(yōu)點,可廣泛用于副溶血弧菌的快速檢測。現(xiàn)已有對江蘇周邊、舟山、上海等地區(qū)副溶血性弧菌分子流行病學(xué)的報道,但缺乏對華東區(qū)域整體的調(diào)查分析,而華東地區(qū)4省1市臨海,是副溶血性弧菌污染的"重災(zāi)區(qū)",加強(qiáng)對該區(qū)域毒力相關(guān)基因的分子流行病學(xué)方面的調(diào)查分析,對防控副溶血性弧菌的大流行性爆發(fā)有重要意義。本文對華東地區(qū)分離到的Vp進(jìn)行大流行相關(guān)毒力基因的檢測和多位點序列分型(MLST)。152株分離株共檢出4株致病株(tdh+或trh+),其中2株為可能形成大流行的菌株(tdh+和toeRS/new+)。MTase檢出率為1.3%,所有分離株不攜帶完整的Ⅲ型分泌系統(tǒng),78.3%的分離株攜帶全套的Ⅵ型分泌系統(tǒng)。152株Vp分為84個STs,其中新的STs有69個。聚類分析表明一部分環(huán)境分離株與臨床致病株看家基因進(jìn)化關(guān)系相近,同種類宿主分離株的STs更有可能生成聚類關(guān)系,此外,歸屬于同源復(fù)合體CC3并非致病株的必要條件。以系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ),對毒力基因分布圖及宿主來源進(jìn)行歸類,發(fā)現(xiàn)環(huán)境分離株分子特征呈多態(tài)性。對華東地區(qū)副溶血性弧菌的流行病學(xué)研究表明,4個致病株和2個可能引起大流行菌株的檢出提示副溶血性弧菌具潛在爆發(fā)隱患,而分子特征的多態(tài)性為疫情的無規(guī)律性散發(fā)提供條件,華東地區(qū)副溶血性弧菌環(huán)境分離株對人們的健康有潛在威脅。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S941.4
【圖文】：

ｔｏｄ？的系統(tǒng)發(fā)育樹由２５種（３０株）弧菌構(gòu)建，ｔｏｘＳ的系統(tǒng)發(fā)育樹由２６逡逑種Ｇ２株）弧菌構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，副溶血性弧菌化ｃｉ？及化ｘＳ均位于單逡逑一進(jìn)化分支上（圖３－１），與其他弧茜進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，表現(xiàn)出良好的進(jìn)化差異。逡逑將副溶血性弧菌ｔｏｅ化Ｓ全序列（Ｇｅｎ沈ａｎｋ邋：邋Ｌ１１％NB１）在ＮＣＢＩ邋ＢＬＡＳＴ網(wǎng)站逡逑比對后結(jié)果顯示，ｔｏｅ／？及ｔｏｃＳ均與副溶血性弧菌高度同源（圖３－２），顯示出逡逑良好的保守性。系統(tǒng)發(fā)育和同源性分析表明，／ｏｘｉ？、／0誠及／0：？：欠－５邋（橫跨ｔｏｊｄ？逡逑及ｔｏｃＳ的序列）均有作為種特異性檢測靴基因的可能。其中對ｔｏｄ？的分析結(jié)逡逑果與先前報道一致，弧菌的ｔｏｄ？序列顯示出多樣性，可作為副溶血性弧菌種逡逑特異性檢測的靴基因Ｐｗｙ。ＭｅｇＡｌｉｇｎ軟件比對上述ｔｏｄ？和化誠序列，錯定種逡逑內(nèi)保守而種間特意的區(qū)域，針對此Ｈ段靴基因分別設(shè)計引物ｐｒｉｍｅｒｓ－民、逡逑ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｓ、ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｒ－Ｓ邋（表邋３－４）。逡逑邐哩Ｉ＂如ｐａ巧姑ｅｍ扣抑乙ｕｓ邐＜４如２巧�。斑娺姟枺蓿郑椋猓颍椋铮瑁螅鳎椋螅椋颍幔椋铄澹峙f４加ＥＵ２４ＣＷ３逡逑一＊邐Ｌ邋Ｖ化化ｐｓ巧ｈａｅｍｏＷ；兇Ｓ邋ＡＱ３８１０邋Ａ的２巧的邐巧｜邐＾邋Ｖ化，ｗ邋0化ｎ扣？邋４７村６－！邋ＪＰＲＣＷ００００巧逡逑＾＿？邐！邐Ｖ也如？

２．５敏感性試驗逡逑Ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｒ－Ｓ對陽性參考株基因組ＤＮＡ的濃度梯度ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝逡逑膠電泳，結(jié)果顯示（圖３－５）當(dāng)陽性ＤＮＡ為２邋ｐｇ時即能在檢測到陽性結(jié)果。逡逑表明引物對副溶血性弧菌有較高的敏感性。逡逑２．６重復(fù)性試驗逡逑Ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｒ－Ｓ邋１０次ＰＣＲ擴(kuò)增試驗結(jié)果全部為陽性，表明引物的重復(fù)性強(qiáng)。逡逑２．７邋ｔｏｃｉ？－ＳＰＣ民與國標(biāo)方法對海產(chǎn)品的檢測結(jié)果逡逑來自華東五省沿海城市的３巧份海鮮樣品，同時用建立的ＰＣＲ和國標(biāo)方法逡逑３６逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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