【摘要】：為了明確鰻弧菌金屬蛋白酶對大菱鲆頭腎細胞的毒性作用機制,本試驗將金屬蛋白酶作用于頭腎細胞,試驗分為對照組(0μg/mL)、低濃度組(1.6μg/mL)、中濃度組(8μg/mL)與高濃度組(40μg/mL)。通過LDH法和MTT法測定細胞膜的完整性和細胞存活率,Hoechst33342熒光染色法檢測細胞凋亡形態(tài),采用流式細胞儀檢測細胞凋亡、活性氧、線粒體膜電位的變化,并利用RT-qPCR、ELISA法檢測凋亡相關基因的表達及酶活變化。試驗結(jié)果表明,與對照組相比,試驗組細胞內(nèi)LDH釋放率隨著脅迫時間延長均有上升趨勢,且均顯著高于對照組(P0.05),以金屬蛋白酶高濃度組24h LDH釋放率最高,為82.61±9.48%;MTT結(jié)果表明低濃度組金屬蛋白酶3h對細胞的毒性作用較小,與對照組無顯著性差異(P0.05),其他時間點均顯著低于對照組(P0.05),24h后細胞存活率為76.19±0.04%,而金屬蛋白酶高濃度組在脅迫細胞6h后,細胞存活率在50%以下;Hoechst 33342熒光染色法和Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果均顯示金屬蛋白酶高濃度組在24h細胞凋亡率最高;膜電位結(jié)果顯示,6～24h金屬蛋白酶低濃度組、中濃度組和高濃度組的膜電位均呈現(xiàn)下降趨勢,且顯著低于對照組(P0.05)。金屬蛋白酶高濃度組活性氧24h時細胞的DCF熒光信號最大且顯著高于對照組(P0.05)。另外,Caspase 3、Caspase 9與Cyt C基因的表達量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,金屬蛋白酶高濃度組Cyt C和Caspase 9基因表達量均在12h時達到最大值,Caspase 3表達量在6h達最高值,且均與對照組具有顯著性差異(P0.05),高濃度組Caspase 3的活性在3～24h內(nèi)呈現(xiàn)上升的趨勢,除3h外,其他時間點均顯著高于對照組(P0.05)。綜上所述,金屬蛋白酶對大菱鲆頭腎細胞具有細胞毒性作用,高濃度金屬蛋白酶可以在短時間內(nèi)誘導頭腎細胞發(fā)生凋亡,且具有一定的時間和劑量關系。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S943
【圖文】：

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大菱鮮CasPase3基因cDNA全長及其推導的氮基酸序列

【參考文獻】

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本文編號：2737671