【摘要】：作為世界上三大養(yǎng)殖蝦類之一,斑節(jié)對蝦以其生長率高,個體大,口味獨特,營養(yǎng)價值高,耐鹽性和在國際市場上持久需求等方面的優(yōu)點優(yōu)于其它品種。但是,目前,斑節(jié)對蝦在其養(yǎng)殖上存在兩個主要問題,一個是疾病,另一個是苗種。缺乏特異性免疫反應和免疫記憶的斑節(jié)對蝦在面對疾病時只能依靠先天免疫系統(tǒng),先天免疫是協(xié)助限制感染的第一道防線,但疾病問題仍然難以控制,斑節(jié)對蝦遭受著一系列不良環(huán)境毒性因子的影響,如病原體,酸堿度,重金屬污染等。Peroxiredoxins(Prxs)是自然界中普遍存在的,多功能的和進化上保守的過氧化物還原酶類,其可以保護細胞免受ROS引起的氧化損傷,在發(fā)育,凋亡,分化和免疫反應中也發(fā)揮重要作用。因此,本研究的目的是探討Prxs超家族成員對免疫和應激反應的作用。在本實驗中,我們鑒定,克隆和表達了來自斑節(jié)對蝦的三個Prxs基因,包括PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn,通過其研究了解過氧化物還原酶Prxs超家族,以幫助緩解對蝦目前面臨的部分養(yǎng)殖難題。在本研究中,PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn的部分cDNA序列是從我們實驗室斑節(jié)對蝦轉錄組庫中獲得。通過分子生物學技術,克隆得到了PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn基因的全長。為研究斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中三種基因存在的潛力,首先,對斑節(jié)對蝦的每個組織進行qRT-PCR以初步了解這三種基因在斑節(jié)對蝦的分布;在細菌免疫感染和不同的環(huán)境毒性脅迫后,檢測鰓和肝胰腺組織中三種基因的轉錄模式,推測它們是否參與免疫應激防御過程;此外,表達并純化三種基因的重組蛋白,測試重組蛋白的抗氧化活性;體外分析研究了三個蛋白的抗菌活性;測試了它們與重金屬和H_2O_2的關系。具體研究內容概括如下:(1)在此,從斑節(jié)對蝦克隆出全長Prx1 cDNA序列(PmPrx1),全長PmPrx1 cDNA為951個堿基對(bp),編碼198個氨基酸的多肽。qRT-PCR結果顯示PmPrx1 mRNA在所有測試組織中普遍表達,并且在免疫相關組織(鰓,肝胰腺)中具有相對較高的表達水平。為探索PmPrx1的免疫和抗應激作用,選擇鰓和肝胰腺作為斑節(jié)對蝦的實驗組織,對斑節(jié)對蝦用細菌(哈維弧菌和無乳鏈球菌)感染和有毒環(huán)境因子進行脅迫。為進一步闡明PmPrx1參與細菌刺激的免疫功能,采用原核表達方法獲得重組PmPrx1蛋白,通過愈創(chuàng)木酚法評估了重組PmPrx1的抗氧化活性,并且結果顯示PmPrx1蛋白以劑量依賴性和溫度依賴性的方式表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。通過固體中瓊脂糖擴散法和液體中進行的細菌生長抑制試驗評估了純化的PmPrx1蛋白的抗菌活性。此外,pRSET-PmPrx1轉染的大腸桿菌對重金屬毒性和H_2O_2氧化應激具有顯著抗性。(2)作為Prxs超家族中唯一一個獨特的非典型2-Cys過氧化物還原酶,Prx5具有特殊的性質,如其酶促機制,廣泛的亞細胞分布和對過氧化物和過氧亞硝酸鹽的高親和力。本實驗中,我們在斑節(jié)對蝦中獲得了Prx5 cDNA全長序列(命名為PmPrx5),全長Prx5 cDNA序列為1686 bp,含有76 bp的5'非翻譯區(qū)(UTR),1040 bp的3'UTR和一個570 bp的開放閱讀框,編碼189個氨基酸殘基,預測分子量為20 kDa,理論等電點為6.29。具有兩個核苷酸序列(AAA),具有poly(A)尾和兩個聚腺苷酸化信號序列(AATAAA)。系統(tǒng)進化樹和多重序列比對表明,PmPrx5與其他物種的Prx5蛋白具有很強的同源性,如與含有高度保守功能域的脊尾白蝦(69%)和羅氏沼蝦(69%)具有高相似性。在所有測試的組織中普遍檢測到PmPrx5 mRNA。在斑節(jié)對蝦感染病原菌,應激于高低滲透壓,酸堿性海水以及重金屬脅迫后,隨著時間的推移,除了在金屬銅和鎘的刺激后PmPrx5轉錄表達下調外,在其他情況下,鰓和肝胰腺中PmPrx5 mRNA表達顯著增加。在大腸桿菌(DE3)中純化的重組PmPrx5蛋白在一定程度上表現(xiàn)出抗氧化活性和抗菌性質。最后,pRSET-PmPrx5轉化的大腸桿菌在應對重金屬毒性應激時得到顯著保護。(3)斑節(jié)對蝦中的PmPrxn被成功鑒定,克隆和依靠原核表達系統(tǒng)進行了蛋白表達。組織特異性表達分析顯示PmPrxn在斑節(jié)對蝦所有測試組織中普遍表達,在肝胰腺中的表達水平最高,隨后是鰓和卵巢。qRT-PCR分析表明,當斑節(jié)對蝦遭受生物和非生物脅迫時,包括哈維氏弧菌,無乳鏈球菌感染和毒性環(huán)境刺激后,PmPrxn mRNA表達具有獨特性,表明PmPrxn可能在響應生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。然后,成功評估出純化的PmPrxn蛋白在體外研究中具有抗菌性質。此外,DE3-pRSET-PmPrxn被顯著保護以抵抗重金屬毒性�？傊�,這項研究提供了關于PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn在防御各種毒性因子中的有用信息,這些有助于進一步闡明Prxs的功能。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

eus monodon）俗稱黑虎蝦，草蝦蝦科、對蝦屬。由于斑節(jié)對蝦生價值高、耐鹽度高、適合大規(guī)模其在國際市場т深受人們喜愛[1]蝦之 ，也是中國重要щ受歡迎[2]。斑節(jié)對蝦在印度洋-太平洋區(qū)以及墨西哥灣北部也有發(fā)現(xiàn)。斑

圖 1-1 哺乳動物 Prxs 結構示意圖[28]Fig. 1-1 Structure diagram of Prx family in mammalian腹果蠅中有 5 種亞型被發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中 3 種斑節(jié)對蝦中有 6 種，包括 種新型 2-CysPrx（],在植物里，17 種 Prxs 由 4 個亞家族，包括 1-Crxs 組成[31]。及功能研究進展 Prxs 是 種重要的膜內蛋白酶，但只有 Prx4 可號序列分泌出膜行使功能，哺乳動物中的 Pr

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本文編號：2738689