【摘要】：作為世界上三大養(yǎng)殖蝦類(lèi)之一,斑節(jié)對(duì)蝦以其生長(zhǎng)率高,個(gè)體大,口味獨(dú)特,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,耐鹽性和在國(guó)際市場(chǎng)上持久需求等方面的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)于其它品種。但是,目前,斑節(jié)對(duì)蝦在其養(yǎng)殖上存在兩個(gè)主要問(wèn)題,一個(gè)是疾病,另一個(gè)是苗種。缺乏特異性免疫反應(yīng)和免疫記憶的斑節(jié)對(duì)蝦在面對(duì)疾病時(shí)只能依靠先天免疫系統(tǒng),先天免疫是協(xié)助限制感染的第一道防線,但疾病問(wèn)題仍然難以控制,斑節(jié)對(duì)蝦遭受著一系列不良環(huán)境毒性因子的影響,如病原體,酸堿度,重金屬污染等。Peroxiredoxins(Prxs)是自然界中普遍存在的,多功能的和進(jìn)化上保守的過(guò)氧化物還原酶類(lèi),其可以保護(hù)細(xì)胞免受ROS引起的氧化損傷,在發(fā)育,凋亡,分化和免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。因此,本研究的目的是探討Prxs超家族成員對(duì)免疫和應(yīng)激反應(yīng)的作用。在本實(shí)驗(yàn)中,我們鑒定,克隆和表達(dá)了來(lái)自斑節(jié)對(duì)蝦的三個(gè)Prxs基因,包括PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn,通過(guò)其研究了解過(guò)氧化物還原酶Prxs超家族,以幫助緩解對(duì)蝦目前面臨的部分養(yǎng)殖難題。在本研究中,PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn的部分cDNA序列是從我們實(shí)驗(yàn)室斑節(jié)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中獲得。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù),克隆得到了PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn基因的全長(zhǎng)。為研究斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖中三種基因存在的潛力,首先,對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的每個(gè)組織進(jìn)行qRT-PCR以初步了解這三種基因在斑節(jié)對(duì)蝦的分布;在細(xì)菌免疫感染和不同的環(huán)境毒性脅迫后,檢測(cè)鰓和肝胰腺組織中三種基因的轉(zhuǎn)錄模式,推測(cè)它們是否參與免疫應(yīng)激防御過(guò)程;此外,表達(dá)并純化三種基因的重組蛋白,測(cè)試重組蛋白的抗氧化活性;體外分析研究了三個(gè)蛋白的抗菌活性;測(cè)試了它們與重金屬和H_2O_2的關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容概括如下:(1)在此,從斑節(jié)對(duì)蝦克隆出全長(zhǎng)Prx1 cDNA序列(PmPrx1),全長(zhǎng)PmPrx1 cDNA為951個(gè)堿基對(duì)(bp),編碼198個(gè)氨基酸的多肽。qRT-PCR結(jié)果顯示PmPrx1 mRNA在所有測(cè)試組織中普遍表達(dá),并且在免疫相關(guān)組織(鰓,肝胰腺)中具有相對(duì)較高的表達(dá)水平。為探索PmPrx1的免疫和抗應(yīng)激作用,選擇鰓和肝胰腺作為斑節(jié)對(duì)蝦的實(shí)驗(yàn)組織,對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦用細(xì)菌(哈維弧菌和無(wú)乳鏈球菌)感染和有毒環(huán)境因子進(jìn)行脅迫。為進(jìn)一步闡明PmPrx1參與細(xì)菌刺激的免疫功能,采用原核表達(dá)方法獲得重組PmPrx1蛋白,通過(guò)愈創(chuàng)木酚法評(píng)估了重組PmPrx1的抗氧化活性,并且結(jié)果顯示PmPrx1蛋白以劑量依賴(lài)性和溫度依賴(lài)性的方式表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。通過(guò)固體中瓊脂糖擴(kuò)散法和液體中進(jìn)行的細(xì)菌生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)評(píng)估了純化的PmPrx1蛋白的抗菌活性。此外,pRSET-PmPrx1轉(zhuǎn)染的大腸桿菌對(duì)重金屬毒性和H_2O_2氧化應(yīng)激具有顯著抗性。(2)作為Prxs超家族中唯一一個(gè)獨(dú)特的非典型2-Cys過(guò)氧化物還原酶,Prx5具有特殊的性質(zhì),如其酶促機(jī)制,廣泛的亞細(xì)胞分布和對(duì)過(guò)氧化物和過(guò)氧亞硝酸鹽的高親和力。本實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)诎吖?jié)對(duì)蝦中獲得了Prx5 cDNA全長(zhǎng)序列(命名為PmPrx5),全長(zhǎng)Prx5 cDNA序列為1686 bp,含有76 bp的5'非翻譯區(qū)(UTR),1040 bp的3'UTR和一個(gè)570 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼189個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量為20 kDa,理論等電點(diǎn)為6.29。具有兩個(gè)核苷酸序列(AAA),具有poly(A)尾和兩個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)序列(AATAAA)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和多重序列比對(duì)表明,PmPrx5與其他物種的Prx5蛋白具有很強(qiáng)的同源性,如與含有高度保守功能域的脊尾白蝦(69%)和羅氏沼蝦(69%)具有高相似性。在所有測(cè)試的組織中普遍檢測(cè)到PmPrx5 mRNA。在斑節(jié)對(duì)蝦感染病原菌,應(yīng)激于高低滲透壓,酸堿性海水以及重金屬脅迫后,隨著時(shí)間的推移,除了在金屬銅和鎘的刺激后PmPrx5轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)外,在其他情況下,鰓和肝胰腺中PmPrx5 mRNA表達(dá)顯著增加。在大腸桿菌(DE3)中純化的重組PmPrx5蛋白在一定程度上表現(xiàn)出抗氧化活性和抗菌性質(zhì)。最后,pRSET-PmPrx5轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在應(yīng)對(duì)重金屬毒性應(yīng)激時(shí)得到顯著保護(hù)。(3)斑節(jié)對(duì)蝦中的PmPrxn被成功鑒定,克隆和依靠原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了蛋白表達(dá)。組織特異性表達(dá)分析顯示PmPrxn在斑節(jié)對(duì)蝦所有測(cè)試組織中普遍表達(dá),在肝胰腺中的表達(dá)水平最高,隨后是鰓和卵巢。qRT-PCR分析表明,當(dāng)斑節(jié)對(duì)蝦遭受生物和非生物脅迫時(shí),包括哈維氏弧菌,無(wú)乳鏈球菌感染和毒性環(huán)境刺激后,PmPrxn mRNA表達(dá)具有獨(dú)特性,表明PmPrxn可能在響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。然后,成功評(píng)估出純化的PmPrxn蛋白在體外研究中具有抗菌性質(zhì)。此外,DE3-pRSET-PmPrxn被顯著保護(hù)以抵抗重金屬毒性�？傊�,這項(xiàng)研究提供了關(guān)于PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn在防御各種毒性因子中的有用信息,這些有助于進(jìn)一步闡明Prxs的功能。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【圖文】：

eus monodon）俗稱(chēng)黑虎蝦，草蝦蝦科、對(duì)蝦屬。由于斑節(jié)對(duì)蝦生價(jià)值高、耐鹽度高、適合大規(guī)模其在國(guó)際市場(chǎng)т深受人們喜愛(ài)[1]蝦之 ，也是中國(guó)重要щ受歡迎[2]。斑節(jié)對(duì)蝦在印度洋-太平洋區(qū)以及墨西哥灣北部也有發(fā)現(xiàn)。斑

圖 1-1 哺乳動(dòng)物 Prxs 結(jié)構(gòu)示意圖[28]Fig. 1-1 Structure diagram of Prx family in mammalian腹果蠅中有 5 種亞型被發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中 3 種斑節(jié)對(duì)蝦中有 6 種，包括 種新型 2-CysPrx（],在植物里，17 種 Prxs 由 4 個(gè)亞家族，包括 1-Crxs 組成[31]。及功能研究進(jìn)展 Prxs 是 種重要的膜內(nèi)蛋白酶，但只有 Prx4 可號(hào)序列分泌出膜行使功能，哺乳動(dòng)物中的 Pr

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