發(fā)布時(shí)間：2020-07-01 05:10

【摘要】：組織蛋白酶D(Cathepsin D)是許多真核生物細(xì)胞中廣泛存在的一種溶酶體天冬氨酸蛋白酶,可以降解胞內(nèi)和胞外蛋白質(zhì)。金屬基質(zhì)蛋白酶2(Matrix metalloproteinase,MMP2)是一種鋅依賴性蛋白內(nèi)切酶,可以降解細(xì)胞外基質(zhì),它們在生物機(jī)體的病理過程中都發(fā)揮著重要作用。羅非魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類。本研究采用其作為實(shí)驗(yàn)對象,采用RACE、分子克隆以及熒光定量PCR技術(shù)等技術(shù),對Cathepsin D基因與MMP2基因進(jìn)行了克隆、功能預(yù)測與組織表達(dá)分析等。主要的研究結(jié)果如下:(1)獲得了羅非魚Cathepsin D基因全長c DNA序列,長為1642bp,包括57bp的5′UTR、394bp的3′UTR和1191bp的編碼區(qū)。1191bp的編碼區(qū)共編碼396個(gè)氨基酸,包括1-18氨基酸組成的信號(hào)肽區(qū)、19-46氨基酸組成的前導(dǎo)肽區(qū)以及47-396氨基酸組成的成熟肽。Cathepsin D基因蛋白質(zhì)前體的理論等電點(diǎn)為6.1,分子量為43.2KD,成熟蛋白的理論等電點(diǎn)為5.52,分子量為38KD。成熟蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(instability index(II))為34.24,屬于一種穩(wěn)定的蛋白,其脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為79.09,總平均疏水指數(shù)(Grand average of hydropathicity(GRAVY))為-0.114,屬于親水性差脂溶性強(qiáng)的蛋白。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)羅非魚cathepsin D基因在各物種之間比較保守,羅非魚與尖吻鱸的同源性高達(dá)89%。與大多數(shù)硬骨魚不同,羅非魚cathepsin D蛋白的131、249和314氨基酸處存在3個(gè)N-glycosylation(N-X-S/T)位點(diǎn)。本研究還克隆獲得了羅非魚cathepsin D基因序列全長,為7628bp,通過對羅非魚cathepsin D基因序列與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)羅非魚cathepsin D基因結(jié)構(gòu)與斑馬魚類似,都是由9個(gè)外顯子區(qū)和8個(gè)內(nèi)含子區(qū)構(gòu)成。(2)通過克隆得到了3033bp的MMP2基因片段,包含95bp的5′UTR、967bp的3′UTR以及1971bp的編碼區(qū)。1971bp的編碼區(qū)共編碼656個(gè)氨基酸,包括1-29氨基酸處的信號(hào)肽區(qū),43-97氨基酸處的前導(dǎo)肽區(qū)以及98-656氨基酸處的成熟肽。成熟的MMP2蛋白包括催化區(qū)、鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū),催化區(qū)含有3個(gè)纖維連接蛋白Ⅱ型結(jié)構(gòu)域,羧基末端區(qū)含有四個(gè)類血紅素結(jié)合蛋白重復(fù)。MMP2基因蛋白質(zhì)前體的理論等電點(diǎn)為5.01,分子量為74.33KDa。成熟的MMP2蛋白的理論等電點(diǎn)為4.91,分子量為70.99KDa,不穩(wěn)定系數(shù)為29.16,屬于一種穩(wěn)定的蛋白,其脂肪指數(shù)為57.11,總平均疏水指數(shù)為-0.529,屬于親水差的蛋白。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)MMP2基因在脊椎動(dòng)物間比較保守,其中羅非魚與紅鰭東方渶的同源性高達(dá)89%。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,cathepsin D基因在健康羅非魚12個(gè)組織中都有表達(dá),但它們的表達(dá)量差異顯著(P0.05)。在頭腎和脾中表達(dá)量較高,腸、腦和血液中次之,心、鰭、眼、肌肉、性腺、肝中表達(dá)量較低,頭腎的表達(dá)量約為心的13倍,脾的表達(dá)量約為心的7倍。對羅非魚進(jìn)行人工攻毒嗜水氣單胞菌后,cathepsin D基因的表達(dá)量在脾、腸、肝和頭腎中均發(fā)生了上調(diào),分別在5h、24h、48h和48h到達(dá)峰值,并隨后開始下降。MMP2基因在健康羅非魚11個(gè)組織中均有表達(dá),但表達(dá)量有顯著差異(P0.05)。在雄性中的精巢、心和眼中表達(dá)量較高,肌肉和鰭次之,肝臟中較低。精巢的表達(dá)量約為肝的14.47倍,心和眼的表達(dá)量分別為肝的8.12倍和7.04倍。人工使羅非魚感染嗜水氣單胞菌后MMP2基因在脾、頭腎和肝中的表達(dá)量發(fā)生明顯上調(diào),分別在5h、24h和48h到達(dá)峰值,隨后也開始下降,并漸漸趨于正常水平。研究結(jié)果說明,隨著外來致病菌的入侵,免疫相關(guān)器官內(nèi)cathepsin D和MMP2基因表達(dá)量發(fā)生先升后降的顯著變化,可能與機(jī)體啟動(dòng)清除致病菌的過程有關(guān),說明cathepsin D和MMP2基因在羅非魚天然免疫過程中發(fā)揮著重要作用。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄧時(shí)銘,肖克宇,陳光榮,蔣國民;基因工程技術(shù)在我國淡水魚類育種上的應(yīng)用[J];水產(chǎn)科技情報(bào);2003年04期

本文編號(hào)：2736320