【摘要】：達(dá)氏鰉(Huso dauricus)起源于距今一億三千萬年的白堊紀(jì),自然種群集中存在于我國黑龍江流域的中下游,是世界上僅存的兩種鰉魚之一。達(dá)氏鰉是淡水水域中個(gè)體最大的魚類,其魚肉營養(yǎng)豐富、鮮香味美,其中它含有的不飽和脂肪酸和造血維生素葉酸是其他魚類的3~5倍;其卵制成的魚子醬更是極其美味,售價(jià)較高,被譽(yù)為“黑黃金”,因此達(dá)氏鰉具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。生長激素(Growth hormone,GH)是由動(dòng)物腦垂體合成、儲(chǔ)存、分泌的一種單一的肽類激素,能夠促進(jìn)其生長、發(fā)育。魚類生長激素不但具有一般生長激素所具有的作用,還能加快合成蛋白質(zhì)、加速降解脂類等功能,此外還擁有調(diào)控滲透壓特別是海與河間洄游性魚類的滲透壓、提高餌料吸收效率等作用,因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。近年來,由于過度的捕撈,使達(dá)氏鰉的野生數(shù)量銳減,個(gè)體也趨于小體化且因其生長周期長,所以應(yīng)用生物學(xué)手段,加快開展其生長激素等相關(guān)基因的研究至關(guān)重要。本研究采用反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)和快速c DNA末端擴(kuò)增法(Rapid Amplification of c DNA Ends,RACE)首次克隆出達(dá)氏鰉生長激素全長c DNA,應(yīng)用其全長序列對(duì)達(dá)氏鰉的分子系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了比對(duì)研究,旨在為從分子水平研究達(dá)氏鰉生長激素作用特點(diǎn)、進(jìn)化機(jī)制以及在形態(tài)分類基礎(chǔ)上研究達(dá)氏鰉的分類地位提供理論依據(jù),并為以后能夠更深入研究該基因做鋪墊。同時(shí),應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù),對(duì)達(dá)氏鰉10種常見組織中的GH m RNA表達(dá)量進(jìn)行了定量分析,從而進(jìn)一步了解魚類GH是否能以旁分泌或自分泌的方式對(duì)其生長、發(fā)育及繁殖起到重要的作用。最后,將生長激素基因進(jìn)行原核表達(dá),并對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,為達(dá)氏鰉GH基因的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:第一,采用RT-PCR方法得到達(dá)氏鰉生長激素中間片段、采用RACE方法得到3’、5’端片段,并將它們拼接在一起,得到達(dá)氏鰉生長激素全長c DNA,總長為1004bp,其中5’非編碼區(qū)為47bp、3’非編碼區(qū)(含Poly A尾30bp)為312bp,開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)為645bp。經(jīng)過BLAST分析ORF的堿基組成,AT占51.32%,GC占48.68%,共編碼214個(gè)氨基酸,分子量為24.25k Da,理論等電點(diǎn)為6.82。翻譯起始密碼ATG,終止密碼TAG。基因及推導(dǎo)的蛋白序列已登入Gen Bank,序列號(hào)為:KP055783。達(dá)氏鰉與其他鱘形目魚類的GH成熟肽進(jìn)行對(duì)比,其氨基酸序列幾乎相同,其一致性高達(dá)98.89%。同源性分析,結(jié)果顯示達(dá)氏鰉與歐洲鰉同源性最高為98.5%,歧化性為1.3%;使用NJ法建立分子進(jìn)化樹,結(jié)果顯示達(dá)氏鰉相對(duì)于哺乳類動(dòng)物,如家鼠和人,它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),與同是硬磷總目的雀鱔目中的長吻雀鱔和大雀鱔的親緣關(guān)系較近,而與歐洲鰉、達(dá)氏鱘、中華鱘的親緣關(guān)系最近。第二,采用Quantitative Real-time PCR方法檢測了GH基因在達(dá)氏鰉肌肉、性腺、胃、腦垂體等10種不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,GH基因不同組織中存在差異性,GH m RNA的表達(dá)量在腦垂體中最高;肌肉、腦次之;而在腸、性腺、胃、心臟、鰓、肝臟、脾臟中只有少量表達(dá)。第三,將達(dá)氏鰉GH基因連接到表達(dá)載體Blunt E1中,構(gòu)建成Blunt E1-OFR重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌株后,優(yōu)化其表達(dá)條件,經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)IPTG為0.6mmol/L,在37℃條件下培養(yǎng)5 h,可得到大量蛋白。經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Polyacrylamide Gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析后,發(fā)現(xiàn)在31k Da左右有蛋白條帶,且與預(yù)測蛋白的大小相接近。
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

GH作用縱觀圖

能夠促進(jìn)其生長、發(fā)育[28]。魚類生長激素分子量為 22kDa 左右，編碼的約 200 個(gè)左右。在魚類中，分類地位相近的其生長激素氨基酸組成幾乎相同位較遠(yuǎn)有比較大的不同，顯現(xiàn)出較為顯著的種屬特異性[29]。魚類生長激素不般生長激素所具有的作用，還能加快合成蛋白質(zhì)、加速降解脂類等功能，此外還滲透壓特別是海與河間洄游性魚類的滲透壓、提高餌料吸收效率等作用，因此在領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值[33]。達(dá)氏鰉（Huso dauricus）隸屬鱘科（Acipenseridae），鰉屬（Huso）。物種起源億三千萬年的白堊紀(jì)，自然種群主要分布在我國黑龍江中下游，是世界上僅存的之一，另一種為歐洲鰉（Huso huso），為冷水魚類。達(dá)氏鰉是淡水水域中個(gè)體最，其魚肉營養(yǎng)豐富、鮮香味美，其中它含有的不飽和脂肪酸和造血維生素葉酸是的 3～5 倍；其卵制成的魚子醬更是極其美味，售價(jià)較高，被譽(yù)為“黑黃金”，因鰉具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]。本實(shí)驗(yàn)的特異性引物通過對(duì)比鱘科魚類 GH 基因保守區(qū)，應(yīng)用 Primer primer 5計(jì)，采用 RT-PCR 和 RACE 技術(shù)首次克隆出達(dá)氏鰉 GH 全長 cDNA（見圖 2-1）子水平上了解達(dá)氏鰉生長、繁殖等規(guī)律做鋪墊。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 馬細(xì)蘭;張勇;黃衛(wèi)人;劉曉春;林浩然;葉衛(wèi);;尼羅羅非魚生長激素及其受體的cDNA克隆與mRNA表達(dá)的雌雄差異[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2006年05期

2 朱欣;肖慧;張德志;唐大明;王威;簡江陵;;達(dá)氏鰉南移培育成熟及全人工繁殖[J];水產(chǎn)科學(xué);2012年01期

3 李文龍,石振廣,王云山,劉建魁;人工養(yǎng)殖達(dá)氏鰉畸形原因及對(duì)策[J];科學(xué)養(yǎng)魚;2005年06期

4 王云山,石振廣,李文龍,朱傳榮;達(dá)氏鰉人工繁殖技術(shù)初步研究[J];水利漁業(yè);2002年02期

5 張為民,張勇,李欣,張利紅,田靜;斜帶石斑魚生長激素cDNA克隆及其在大腸桿菌中的融合表達(dá)[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2003年05期

6 楊瑤,張海萍,張愛萍,周天強(qiáng);草魚生長激素cDNA基因的克隆及序列分析　[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2001年03期

7 白俊杰,馬進(jìn),簡清,李新輝,羅建仁;鯉魚(Cyprinus carpio)生長激素基因克隆及原核表達(dá)[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);1999年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 石振廣;達(dá)氏鰉人工繁殖和養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究[D];中國海洋大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2736084