【摘要】：中華絨螯蟹俗稱河蟹、大閘蟹,是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖蟹類。在養(yǎng)殖過程中,雄蟹生長(zhǎng)快,攻擊性強(qiáng),容易導(dǎo)致雌蟹死亡;養(yǎng)殖后期雌蟹性早熟會(huì)降低商品規(guī)格。單性化養(yǎng)殖是提高中華絨螯蟹養(yǎng)殖效益的有效途徑,因此,有必要開展中華絨螯蟹性別調(diào)控機(jī)制方面的研究,為實(shí)現(xiàn)單性化苗種繁育提供理論基礎(chǔ)。促雄腺是雄性甲殼動(dòng)物特有的腺體,其分泌的激素為促雄腺激素,具有調(diào)控雄性分化、維持雄性第二性征和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的功能。本研究分別對(duì)增殖期和分泌期促雄腺轉(zhuǎn)錄組和miRNAs進(jìn)行測(cè)序分析,篩選與促雄腺發(fā)育相關(guān)的基因,并預(yù)測(cè)這些基因可能參與的調(diào)控通路�？寺×酥腥A絨螯蟹促雄腺基因(Es-IAG)的全長(zhǎng)序列,并進(jìn)行了表達(dá)分析和干擾研究,為中華絨螯蟹性別分化研究奠定了基礎(chǔ)。利用IlluminaHiseq平臺(tái),對(duì)中華絨螯蟹增殖期和分泌期促雄腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,比較轉(zhuǎn)錄組分析表明,兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組共得到72000條基因,其中差異表達(dá)基因4027條;GO分析顯示,差異表達(dá)基因的功能主要集中在蛋白質(zhì)的合成和分泌等生物學(xué)過程,并富集到轉(zhuǎn)錄、翻譯及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)通路中;進(jìn)一步篩選出可能參與精巢發(fā)育及雄性性征維持的相關(guān)基因?yàn)镋s-IAG,TRA-2,Cytochrome p450,SRY,和FTZ-F1;可能參與精子發(fā)生調(diào)控的相關(guān)基因?yàn)閁biquitin、serpin、CathepsinA和CathepsinD;核糖體通路中44條基因表達(dá)顯著上調(diào),2條顯著下調(diào),說明了分泌期促雄腺中促雄腺激素的分泌量增加的原因。有3條基因被注釋為胰島素受體基因,在胰島素信號(hào)通路中發(fā)揮重要調(diào)控作用,通過不同信號(hào)通路參與調(diào)控促雄腺細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞凋亡和蛋白合成。其中,Unigene10231被注釋到卵母細(xì)胞成熟與減數(shù)分裂通路中,提示可能與卵細(xì)胞成熟有關(guān),CL1931.Contig3可能是胰島素樣生長(zhǎng)因子的受體,與生長(zhǎng)相關(guān)。分析了刺激神經(jīng)的配體受體相互作用通路,在分泌期,褪黑素受體、5-羥基色胺受體1基因的表達(dá)量顯著下調(diào),提示5-羥基色胺和章魚胺通過促雄腺調(diào)控精巢發(fā)育;章魚胺受體的表達(dá)量顯著上調(diào),章魚胺與攻擊、交配行為正相關(guān),提示章魚通過促雄腺調(diào)控雄性爭(zhēng)斗和交配行為的機(jī)制。利用從轉(zhuǎn)錄組中獲得的Es-IAG片段,通過RACE技術(shù),克隆Es-IAG基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹粗雄性激素的氨基酸序列與藍(lán)蟹(C.sapdus)的序列一致性最高,為44%,其次是擬穴青蟹(S.paramamosain),相似性達(dá)42%。中華絨螯蟹促雄腺激素前體多肽中存在分泌型信號(hào)肽,說明該激素為分泌型蛋白,共存在兩個(gè)糖基化位點(diǎn),未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域;在促雄腺激素前體多肽的C鏈和A鏈,C鏈和B鏈之間存在典型的R**R蛋白酶酶切位點(diǎn),提示促雄腺激素前體多肽是在切除C鏈后成為成熟的促雄腺激素的,成熟肽鏈中的6個(gè)保守的Cys殘基形成兩個(gè)鏈間二硫鍵和一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵,在三維結(jié)構(gòu)上與其它甲殼動(dòng)物保守位點(diǎn)的一致性,充分說明了甲殼類動(dòng)物IAG基因的序列結(jié)構(gòu)在關(guān)鍵位點(diǎn)的進(jìn)化上是高度保守的。與其它已報(bào)道的甲殼動(dòng)物促雄腺激素氨基酸序列做系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹和藍(lán)蟹、擬穴青蟹的親緣關(guān)系最近,并與果蠅、廄螯蠅聚為一支。利用熒光定量PCR技術(shù),檢測(cè)中華絨螯蟹16個(gè)連續(xù)發(fā)育時(shí)期LAG基因的表達(dá)情況,包括受精卵、囊胚期、原腸期、眼點(diǎn)期和心跳期,以及蚤狀幼體、大眼幼體和幼蟹Ⅰ～Ⅴ期雄體,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雄性Ⅰ期幼蟹體內(nèi)Es-IAG基因的表達(dá)量顯著升高,外部形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),Ⅰ期幼蟹開始出現(xiàn)性別相關(guān)附肢的分化,預(yù)示著Ⅰ期幼蟹階段是中華絨螯蟹性別分化的關(guān)鍵期。根據(jù)Es-IAG基因序列設(shè)計(jì)3個(gè)SiRNA,干擾扣蟹體內(nèi)Es-IAG的表達(dá),注射24小時(shí)后,利用熒光定量PCR檢測(cè)Es-IAG基因的表達(dá)情況,其中SiRNA-391的干擾效率達(dá)到67%。利用浸泡法干擾大眼幼體中Es-IAG基因的表達(dá),能顯著抑制Ⅰ期幼蟹雄性附肢的發(fā)育。利用HiSeq高通量測(cè)序技術(shù),檢測(cè)中華絨螯蟹增殖期和分泌期促雄腺中small RNA的表達(dá)情況,共篩選出已知miRNA3719條,差異表達(dá)的miRNA有2246條,其中1780條在分泌期促雄腺中的表達(dá)量顯著下調(diào),466條顯著上調(diào)。預(yù)測(cè)其中Let-7可能參與了精巢的發(fā)育,以Es-IAG為靶基因的miRNA有27個(gè),預(yù)測(cè)其中miR-197、miR-2443和miRNA-6368可能參與促雄腺的發(fā)育調(diào)控;通過GO分析,發(fā)現(xiàn)靶基因富集的生物學(xué)功能主要包括生物組分的合成、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞部分和綁定等,這些功能與促雄腺的增殖、分泌和調(diào)控功能密切相關(guān)。差異表達(dá)miRNA中,以性別發(fā)育相關(guān)基因?yàn)榘谢虻膍iRNA,可能是參與性別發(fā)育的關(guān)鍵miRNA。共篩選出65個(gè)新miRNA,功能主要集中于生理調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、代謝過程及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程,為進(jìn)一步揭示中華絨螯蟹性別調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

＾邐－Ｊｆｃ—逡逑１刖ｇ逡逑中華線螯蟹■圖１－１），俗名河蟹，屬甲殼綱，十足目，方蟹科，逡逑絨螯蟹屬，其適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蟹類。中逡逑華絨螯蟹自然分布于我國(guó)渤海、黃海與東海諸岸，自長(zhǎng)江口的崇明島到湖北省、浙江省逡逑是我國(guó)著名長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹的主產(chǎn)地，其中以陽澄湖大閘蟹品質(zhì)最佳，久負(fù)盛名。逡逑自上世紀(jì)８０年代突破中華絨螯蟹人工育苗技術(shù)以來，人工養(yǎng)殖區(qū)不斷向內(nèi)陸擴(kuò)大，遍逡逑布全國(guó)各地（趙乃剛等，１９８８），目前中華絨螯蟹規(guī)模化養(yǎng)殖區(qū)主要集中在江蘇、安徽、逡逑湖北等省，２０１４年，國(guó)內(nèi)總產(chǎn)量達(dá)到了邋７５萬噸，創(chuàng)歷史新高。經(jīng)多年實(shí)踐積累，中華逡逑絨螯蟹人工養(yǎng)殖技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化模式日漸成熟，各地根據(jù)資源優(yōu)勢(shì)逐漸形成了苗種繁育、逡逑扣蟹養(yǎng)殖、成蟹養(yǎng)殖等不同特色的產(chǎn)業(yè)化基地

邐山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文算公式如下：逡逑ｄ＜ｖ－逡逑ｐ�。纾氩汀瑰义希澹蹂澹╁义辖�(jīng)過多重檢驗(yàn)校正后，選擇ＱｖａｌｕｅＳ０．０５的Ｐａｔｈｗａｙ定義為在差異表達(dá)基因著富集的Ｐａｔｈｗａｙ。Ｑ－ｖａｌｕｅ和ＦＤＲ類似，都是對(duì)ｐ－ｖａｌｕｅ的一種校正。某一個(gè)假檢驗(yàn)的Ｑ－ｖａｌｕｅ就是ＦＤＲ的最小值，在這些ＦＤＲ下該假設(shè)檢驗(yàn)可以被認(rèn)為是顯的。逡逑比較轉(zhuǎn)錄組分析流程圖：逡逑

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本文編號(hào)：2734716