【摘要】：鯉春病毒血癥(Spring virernia of carp,SVC)是由鯉春病毒血癥病毒(Spring virernia carp virus,SVCV)引起的,能夠造成多種鯉科魚類大量死亡的傳染性疾病。它是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)必報(bào)的重要疫病,也是我國2008年頒布的動(dòng)物疫病病種名錄中的一類動(dòng)物疫病。該病一般發(fā)生于春季,具有流行范圍廣、發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn),目前尚無有效的防治方法。對(duì)于病毒病的防控,疫苗一直是最為理想的選擇。其中口服疫苗是當(dāng)前最受歡迎的魚用疫苗,可用于規(guī)�；庖�,解決了免疫操作工作量大、魚苗免疫難等問題。因此,本研究擬利用酵母表面展示技術(shù),將SVCV糖蛋白(Glycoprotein,G)展示于釀酒酵母細(xì)胞表面,口服免疫鯉魚(10±2 g)。通過測(cè)定血清中和抗體效價(jià)、免疫相關(guān)基因表達(dá)量變化以及相對(duì)免疫保護(hù)率等指標(biāo),對(duì)所構(gòu)建的酵母活載體口服疫苗的免疫保護(hù)效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1、以SVCV shlj1分離株基因組RNA為模板,通過RT-PCR技術(shù),體外擴(kuò)增獲得SVCV表面糖蛋白的基因開放閱讀框(1530 bp)片段,將其克隆至釀酒酵母(EBY100)表面展示載體pYD1,構(gòu)建重組質(zhì)粒pYD1-G。利用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pYD1-G導(dǎo)入釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)YNB選擇培養(yǎng)基篩選和菌液PCR的鑒定,挑選出陽性轉(zhuǎn)化子,對(duì)其進(jìn)行2%半乳糖誘導(dǎo)。利用間接免疫熒光抗體檢測(cè)技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)SVCV G蛋白的酵母表面展示情況。間接免疫熒光抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后的酵母細(xì)胞EBY100-pYD1-G能產(chǎn)生特異性紅色熒光,且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,紅色熒光的酵母細(xì)胞比例不斷增加。利用Image J軟件對(duì)免疫熒光鏡檢視野(n=10)進(jìn)行分析可知,誘導(dǎo)0、24 h、48 h、72 h陽性酵母細(xì)胞所占比例平均值分別為8.38%、24.20%、55.30%和72.41%,且各組之間陽性酵母比例差異顯著(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)0、24 h、48 h、72 h時(shí),酵母細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度分別為2112、7086、10236、10554,酵母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與誘導(dǎo)時(shí)間呈正比。但誘導(dǎo)48 h酵母細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度與誘導(dǎo)72 h相比差異不顯著。綜合間接免疫熒光抗體檢測(cè)結(jié)果和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,本研究選取48 h為SVCV糖蛋白酵母表面展示的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。2、大量制備表達(dá)SVCV G蛋白的重組酵母菌,利用無菌PBS調(diào)節(jié)菌液終濃度為1×10~9CPU/mL,用以免疫幼鯉(10±2 g),每次口服灌喂100μL。分別設(shè)置單次免疫EBY100-pYD1-G組(連續(xù)免疫7 d)、多次免疫EBY100-pYD1-G組(免疫2次,間隔7 d,每次連續(xù)免疫7 d)以及EBY100-pYD1組(單次免疫組和多次免疫組)。于免疫后的第7 d、14 d、21 d、28 d采集鯉魚的頭腎和脾臟,利用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Reverse Transcription Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)檢測(cè)組織器官中TNF-α、CD4、IgT相對(duì)表達(dá)水平;于免疫后第42d,利用上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC)檢測(cè)各組鯉魚血清SVCV中和抗體效價(jià);于免疫后的第30d,用10~6.28.28 TCID_(50)/mL的SVCV病毒培養(yǎng)液,采用濃度100TCID_(50)/mL,對(duì)免疫后的幼鯉進(jìn)行腹腔注射攻毒,每尾接種50μL,連續(xù)觀察21 d記錄鯉魚的死亡情況,利用公式RPS=[1-(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)]×100%,計(jì)算口服疫苗的相對(duì)保護(hù)效率,以評(píng)價(jià)重組酵母菌的免疫保護(hù)效力。免疫相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定結(jié)果顯示,口服重組酵母菌EBY100-pYD1-G實(shí)驗(yàn)組中CD4、TNF-α和IgT基因表達(dá)水平均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào),各基因表達(dá)水平均呈現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)。CD4基因表達(dá)量于免疫后的21 d達(dá)到峰值,與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05)。免疫后第28 d,在頭腎和脾臟中,多次免疫EBY100-pYD1-G組CD4表達(dá)量分別為單次免疫EBY100-pYD1-G組的3.26倍和3.19倍,差異顯著(P0.05)。TNF-α基因表達(dá)量于免疫后的21 d達(dá)到峰值,與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05),且頭腎中多次免疫EBY100-pYD1-G組TNF-α基因表達(dá)量顯著升高,是單次免疫EBY100-pYD1-G組的3.29倍,差異顯著(P0.05);在脾臟中多次免疫EBY100-pYD1-G組和單次免疫EBY100-pYD1-G組差異不顯著。Ig-T基因在14 d時(shí)達(dá)到最大值,與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05),且在頭腎和脾臟中,多次免疫EBY100-pYD1-G組Ig-T基因表達(dá)量出現(xiàn)大幅度的提高,分別是單次免疫EBY100-pYD1-G組的3.18倍和3.07倍,差異顯著(P0.05)。血清中和抗體效價(jià)結(jié)果顯示單次免疫EBY100-pYD1-G組和多次免疫EBY100-pYD1-G組中和抗體平均效價(jià)分別為31.9和40.6,而EBY100-pYD1免疫組鯉魚血清中無任何SVCV中和抗體,各組之間均差異顯著(P0.05)。免疫保護(hù)率分析結(jié)果顯示,單次免疫EBY100-pYD1-G和多次免疫EBY100-pYD1-G的相對(duì)保護(hù)率分別為37.14%和43.24%,二者之間差異顯著(P0.05)。該結(jié)果表明免疫EBY100-pYD1-G重組酵母菌能夠顯著降低鯉魚的死亡率,且多次免疫組免疫效果顯著優(yōu)于單次免疫組。綜上所述,本研究制備的SVCV酵母活載體口服疫苗能夠刺激鯉魚產(chǎn)生特異性和非特異性免疫應(yīng)答,對(duì)抵抗SVCV侵染有顯著的保護(hù)作用,有望成為預(yù)防SVCV的新型口服疫苗。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S943
【圖文】：

圖 1 .鯉春病毒血癥病毒（carp spring virernia virus, SVCV）病毒結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)接順序，引自 http://viralzone.expasy.org/4657Fig 1. Structure, genomic and linkage of carp spring virernia virus (SVCV1.2 SVCV 的分類特征及流行情況迄今已報(bào)道的魚類彈狀病毒（Fish rhabdovirus）有十幾種，鯉春病毒（SVCV）是其中的一種，此外還包括病毒性出血敗血癥病毒（Viral haemsepticemia virus，VHSV）、傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hemnecrosis virus，IHNV）、日本牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRR魚苗彈狀病毒、烏鱧彈狀病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）、彈狀�。≧habdovirus 903/87, 903/87）、鱖魚彈狀病毒（Mandarin fish Siniperrhabdovirus，SCRV）、胭脂魚彈狀病毒（Chinese sucker rhabdovirus，C新近分離出的海鮭彈狀病毒 28/97（Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV 2[16~19]。彈狀病毒科包括水泡性病毒屬（Vesiculovirus）、狂犬病毒屬（Lyss暫 時(shí) 熱 病 毒 屬 （ Ephemerovirus ） 和 粒 彈 狀 病 毒 屬 （ 諾 拉 彈 狀 病Novirhabdovirus）。其中粒彈狀病毒屬是國際病毒分類委員會(huì)第 7 次報(bào)告

圖 2 a 凝集素酵母表面展示系統(tǒng)Fig. 2 a-agglutinin-based display system和意義殖業(yè)飛速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖已代替?zhèn)鹘y(tǒng)養(yǎng)殖模病害問題卻是阻礙集約化養(yǎng)殖發(fā)展的問題之一成無法彌補(bǔ)的經(jīng)濟(jì)損失。鯉科魚類作為我國重水養(yǎng)殖的 50%以上，每年產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)收

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本文編號(hào)：2734767