【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)屬于我國特有淡水珍珠蚌,所產(chǎn)珍珠產(chǎn)量已達(dá)到世界珍珠總產(chǎn)量的80%以上。研究表明,基質(zhì)蛋白作為貝殼和珍珠有機(jī)成分中的重要組成,對貝殼和珍珠形成發(fā)揮著重要作用。對基質(zhì)蛋白的研究、鑒定和分析對我國珍珠產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)從三角帆蚌中分離鑒定出2個(gè)貝殼基質(zhì)蛋白基因,并對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行初步的探究。從三角帆蚌外套膜中克隆得到2個(gè)基質(zhì)蛋白基因hic24和Hc-temptin。其中hic24基因cDNA序列全長為756bp,擁有一個(gè)654bp的開放閱讀框,理論分子量為23.5 kDa,等電點(diǎn)為6.36,為一個(gè)酸性基質(zhì)蛋白。hic24基因編碼217個(gè)氨基酸,包括一個(gè)18個(gè)氨基酸的信號肽。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其主要為β折疊結(jié)構(gòu),同時(shí)該序列富含Gly殘基,占氨基酸含量的11.5%。Hc-temptin基因cDNA序列全長為884bp,含有一個(gè)411bp的開放閱讀框(ORF),編碼136個(gè)氨基酸。理論分子量為14.7 kDa,等電點(diǎn)為7.60。預(yù)測前21個(gè)氨基酸為信號肽,氨基酸組成中富含Ser、Asn以及Gly殘基,分別占氨基酸含量的10.3%、10.3%、9.6%。通過組織熒光定量顯示,兩個(gè)基質(zhì)蛋白基因均在外套膜組織中特異性表達(dá)較高。在原位雜交實(shí)驗(yàn)中,hic24基因在外套膜中央膜背上皮細(xì)胞中特異性表達(dá),Hc-temptin基因在外套膜邊緣膜背上皮細(xì)胞中特異性表達(dá),因此推測hic24基質(zhì)蛋白基因參與了貝殼珍珠層的形成,Hc-temptin基因可能在貝殼棱柱層形成時(shí)起重要作用。在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中,注射20μg/100μL以及40μg/100μL的dsRNA后,通過熒光定量實(shí)驗(yàn),檢測干擾后兩個(gè)基質(zhì)蛋白基因在外套膜中的表達(dá)量。結(jié)果顯示,hic24和Hc-temptin基因在外套膜中的表達(dá)量都顯著下降,在掃描電鏡觀察下,hic24基因?qū)φ渲閷游氖男螒B(tài)、數(shù)量以及晶體成核產(chǎn)生了影響,而棱柱層的結(jié)構(gòu)無明顯變化,推測hic24基因參與珍珠層成核以及晶體形態(tài)和生長的調(diào)節(jié)。Hc-temptin基因?qū)ω悮だ庵鶎优c珍珠層結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生了影響,推測Hc-temptin基因參與了貝殼棱柱層與珍珠層晶體形態(tài)和生長的調(diào)節(jié)。珍珠在形成過程中經(jīng)過兩個(gè)連續(xù)階段:無序沉積和有序沉積。通過插片實(shí)驗(yàn)探究兩個(gè)基質(zhì)蛋白基因在珍珠形成過程中起到的作用。對兩個(gè)基質(zhì)蛋白基因在珍珠囊形成時(shí)熒光定量檢測結(jié)果顯示,基質(zhì)蛋白基因hic24和Hc-temptin在無序沉積階段時(shí)表達(dá)量較低,但是在有序沉積階段表達(dá)量都顯著提高。推測hic24和Hc-temptin基因在調(diào)控珍珠層的生長。通過破殼修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究hic24和Hc-temptin在貝殼礦化過程中的作用。對三角帆蚌貝殼進(jìn)行破殼處理后進(jìn)行觀察,以及對破殼位置處的外套膜進(jìn)行熒光定量檢測分析。在破殼修復(fù)過程中,可以觀察到,在破殼處首先形成角質(zhì)層,然后棱柱層開始堆積生長,最后形成珍珠層。在熒光定量結(jié)果顯示中,hic24在貝殼棱柱層與珍珠層的生長期間表達(dá)量逐漸增加,高于初始時(shí)的表達(dá)量,推測基質(zhì)蛋白基因hic24對貝殼棱柱層與珍珠層的生長都起作用。Hc-temptin在貝殼棱柱層的生長期表達(dá)量逐漸增加,而在珍珠層生長時(shí)的表達(dá)量趨于初始時(shí)表達(dá)量,推測基質(zhì)蛋白基因Hc-temptin參與了貝殼棱柱層的生長,并與其他基質(zhì)蛋白共同作用于珍珠層的生長。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

-RACE 所的片段拼接得到全長為 756bp 的 hic24 序列（圖2-1），根據(jù)分析表明，序列包含一個(gè) 654bp 的開放閱讀框（ORF），從第 33 位 ATG密碼子開始，在第 686 位的 TAA 密碼子處終止，編碼 217 個(gè)氨基酸。根據(jù)軟件預(yù)測 hic24 的含有一個(gè)長度為 18 個(gè)氨基酸的信號肽，理論分子量為 23.5kDa，等電點(diǎn)為 6.36。在去掉信號肽，再次檢測理論分子量為 21.7kDa

2-2：Hc-temptin 基因及氨基酸序列，下劃線為信號肽，（AATATA）為多腺苷酸化信號ig.2-2: Hc-temptin gene and amino acid sequence. Underlined for the signal peptide, (AATATA)the polyadenylation signal.用 bioedit 軟件對基質(zhì)蛋白基因 Hc-temptin 與雙臍螺（Biomphalaria glabrata洲牡蠣（Crassostrea virginica）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）、長牡Crassostrea gigas）、海蝸牛（Aplysia californica）、福壽螺（Pomacea canaliculata基質(zhì)蛋白基因進(jìn)行多重比對分析，結(jié)果顯示，Hc-temptin 與雙殼貝類有著較高似度（圖 2-3）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 汪桂玲;袁一鳴;李家樂;;中國五大湖三角帆蚌群體遺傳多樣性及親緣關(guān)系的SSR分析[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2007年02期

2 張剛生,謝先德;貝殼珍珠層微結(jié)構(gòu)及成因理論[J];礦物巖石;2000年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 謝雷;三角帆蚌珍珠質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)、礦化機(jī)制以及珍珠質(zhì)涂層生長的研究[D];浙江大學(xué);2009年

本文編號：2734192