【摘要】：波吉卵囊藻(Oocystis borgei)是高位對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中后期常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)種,其種群穩(wěn)定適應(yīng)能力強(qiáng),能有效降低養(yǎng)殖池塘水體中氨氮和亞硝態(tài)氮等有害物質(zhì),在對(duì)蝦養(yǎng)殖水體調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。十多年來(lái),實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了波吉卵囊藻的培養(yǎng)生物學(xué)的研究和應(yīng)用推廣,其應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)在對(duì)蝦養(yǎng)殖中得以體現(xiàn),但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其分子生物學(xué)研究幾乎空白,同時(shí)缺少相應(yīng)的研究工具。因此本文以波吉卵囊藻作為實(shí)驗(yàn)材料,首次嘗試通過(guò)基因工程技術(shù)手段構(gòu)建其遺傳轉(zhuǎn)化體系,并對(duì)波吉卵囊藻進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析,從而為波吉卵囊藻的分子生物學(xué)相關(guān)研究提供工具和依據(jù)。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)本研究通過(guò)測(cè)定藻體生物量、葉綠素含量及觀察藻液顏色變化,綜合評(píng)定了波吉卵囊藻對(duì)10種抗生素的敏感性。結(jié)果表明:(1)波吉卵囊藻對(duì)博來(lái)霉素非常敏感,25μg/mL的博來(lái)霉素即能完全抑制藻體生長(zhǎng),葉綠素含量極顯著低于對(duì)照組(P0.01),藻體顏色發(fā)黃變白,可作為波吉卵囊藻遺傳轉(zhuǎn)化中的篩選試劑;(2)紅霉素和氯霉素各濃度的處理都會(huì)使藻體生物量和葉綠素含量極顯著降低(P0.01),但是溶解紅霉素和氯霉素的乙醇溶劑會(huì)對(duì)藻體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制,不適用作篩選試劑;(3)波吉卵囊藻對(duì)氨芐青霉素、遺傳霉素、慶大霉素、羧芐青霉素、青霉素以及卡那霉素不敏感,這幾種抗生素甚至在一定的濃度內(nèi)還會(huì)促進(jìn)藻體的生長(zhǎng)和/或葉綠素含量的提升。此外低濃度的鏈霉素亦可促進(jìn)藻體葉綠素含量的提升。(4)在固體培養(yǎng)條件下3μg/mL的博來(lái)霉素即能抑制波吉卵囊藻的生長(zhǎng),可作為波吉卵囊藻的遺傳轉(zhuǎn)化篩選試劑。(2)通過(guò)離心洗滌法有效的去除波吉卵囊藻中霉菌污染后,再采用溶菌酶預(yù)處理結(jié)合抗生素(400μg/mL氨芐青霉素、400μg/mL慶大霉素、400μg/mL卡那霉素和200μg/mL鏈霉素)的方法去除藻液中的細(xì)菌,通過(guò)顯微鏡鏡檢觀察及細(xì)菌和真菌平板檢測(cè),均未觀察到雜菌的存在,由此獲得了無(wú)菌的波吉卵囊藻,經(jīng)五次傳代培養(yǎng)后成功地建立了波吉卵囊藻的無(wú)菌培養(yǎng)體系。(3)本研究采用SYTOX~(TM)Green(SG)熒光染色法來(lái)評(píng)估波吉卵囊藻細(xì)胞膜的滲透性及完整性,確定了SG染色劑量為20μM,避光染色20min以上可以作為2×10~7個(gè)細(xì)胞/mL細(xì)胞密度的波吉卵囊藻的最佳染色條件。通過(guò)使用流式細(xì)胞儀結(jié)合SG染色法得出波吉卵囊藻滲透性和存活率的交叉點(diǎn)在550V左右,并將550V電壓應(yīng)用于質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中。本文以波吉卵囊藻細(xì)胞為受體細(xì)胞,通過(guò)電擊法并采用上述得出的電擊條件嘗試將含有CaMV 35S啟動(dòng)子、Omega增強(qiáng)子、EGFP報(bào)告基因以及ble選擇標(biāo)記基因的載體pOb-EGFP-2A導(dǎo)入藻細(xì)胞中,以期構(gòu)建出波吉卵囊藻的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系,該研究為波吉卵囊藻穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建提供了重要的參考資料。(4)本研究通過(guò)Illumina Hiseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)波吉卵囊藻細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)去除低質(zhì)量的raw reads共獲得6.05Gb Clean Data,利用Trinity軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝,共獲得了35,873條Unigenes,其中長(zhǎng)度在1kb以上的Unigene有7,837條。采用BLAST相似性比對(duì)方法,把這些序列與NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共有11,032條Unigene得到了注釋。有5,201條Unigenes獲得了GO注釋并分類(lèi)到46個(gè)功能類(lèi)別中,有5,018條Unigenes被歸納到COG的26個(gè)功能分類(lèi),有9,327條Unigenes被歸納到eggNOG的25個(gè)功能分類(lèi),有6,276條Unigenes被歸納到KOG的25個(gè)功能分類(lèi).有4,945條Unigenes被KEGG注釋,有8,331條Unigenes被Pfam注釋,有5,844條Unigenes被Swissprot注釋,有9,860條Unigenes被nr注釋。從11,032條Unigenes中共找到2,617個(gè)SSR位點(diǎn)。波吉卵囊藻的轉(zhuǎn)錄組信息為今后相關(guān)研究與應(yīng)用提供了豐富的資源和線索。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S917.3
【圖文】：

17圖 2-2 不同質(zhì)量濃度的 10 種抗生素對(duì)波吉卵囊藻葉綠素含量的影響Fig. 2-2 Effects of ten antibiotics with different mass concentration on Chlorophyll content ofOocystis borgei除了直接測(cè)定藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和葉綠素含量，藻液顏色變化同樣能夠反應(yīng)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。從圖 2-3 可以看出，與對(duì)照組(0μg/mL)鮮綠色藻液相比，經(jīng)過(guò)高濃度的鏈霉素以及分別經(jīng)不同質(zhì)量濃度博來(lái)霉素、氯霉素和紅霉素處理的藻液綠色不明顯，

17圖 2-2 不同質(zhì)量濃度的 10 種抗生素對(duì)波吉卵囊藻葉綠素含量的影響Fig. 2-2 Effects of ten antibiotics with different mass concentration on Chlorophyll content ofOocystis borgei除了直接測(cè)定藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和葉綠素含量，藻液顏色變化同樣能夠反應(yīng)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。從圖 2-3 可以看出，與對(duì)照組(0μg/mL)鮮綠色藻液相比，經(jīng)過(guò)高濃度的鏈霉素以及分別經(jīng)不同質(zhì)量濃度博來(lái)霉素、氯霉素和紅霉素處理的藻液綠色不明顯，

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本文編號(hào)：2732106