【摘要】：草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)感染引起的傳染性草魚出血病,嚴重制約了草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展。赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)和草魚(Ctenopharymgodon idellus)同屬于鯉科,雅羅魚亞科�；谡n題組團隊的前期研究結(jié)果赤眼鱒和草魚對GCRV的不同表型性狀,為探討TLRs(Toll like receptors)通路中相關(guān)基因的表達特性,本研究克隆赤眼鱒TLRs通路中相關(guān)基因,分析其應(yīng)對GCRV的表達特性;并結(jié)合分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對比分析赤眼鱒TLR22(ScTLR22)和草魚TLR22(CiTLR22)在識別和應(yīng)對GCRV感染的功能差異,以期從TLRs受體層面對赤眼鱒和草魚表現(xiàn)出不同的GCRV抗性表型提供一定的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1赤眼鱒TLRs通路抗病毒相關(guān)基因克隆與表達特性分析對赤眼鱒TLRs通路中抗病毒相關(guān)基因TLR22,MyD88(Myeloid differentiation primary response protein 88)和IRF3(IFN regulatory factor 3)基因進行了cDNA克隆和應(yīng)對GCRV的表達特性分析。結(jié)果顯示:赤眼鱒TLR22,MyD88和IRF3均參與了機體的抗GCRV病毒免疫反應(yīng),且體外過表達赤眼鱒TLR22和IRF3能抑制GCRV在CIK細胞中的復(fù)制。2赤眼鱒和草魚TLR22基因的結(jié)構(gòu)特征分析對赤眼鱒和草魚TLR22結(jié)構(gòu)特性比較分析結(jié)果顯示,ScTLR22最后一個LRR(LRR18)在LRR-CT(C-terminal LRR domain)上游12個氨基酸處,和斑馬魚、鯉魚相似,而CiTLR22的最后一個LRR(LRR17)在LRR-CT上游60個氨基酸處;ScTLR22的TIR結(jié)構(gòu)域中3個保守區(qū)域氨基酸序列和斑馬魚、鯉魚等完全一致,而和草魚相比,Box1和Box2中均有一個氨基酸突變。為探討赤眼鱒和草魚TLR22識別區(qū)域的結(jié)構(gòu)差異是否導(dǎo)致不同的識別能力,對赤眼鱒和草魚TLR22的識別區(qū)域和dsRNA類似物poly(I:C)的分子對接結(jié)果顯示:ScTLR22和poly(I:C)形成的復(fù)合物在綁定能、分子間能量、氫鍵數(shù)量和鍵長等方面均優(yōu)于CiTLR22。因此推斷,ScTLR22胞外識別區(qū)域結(jié)合poly(I:C)的能力比CiTLR22強。3赤眼鱒和草魚TLR22識別GCRV誘導(dǎo)抗病毒因子表達能力比較為驗證赤眼鱒和草魚TLR22識別區(qū)域結(jié)構(gòu)差異和功能的關(guān)系,分別在CIK(Ctenopharyngodon idella kidney)細胞中過表達ScTLR22、CiTLR22和融合表達ScTLR22的識別區(qū)域和CiTLR22跨膜結(jié)構(gòu)域和TIR信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ScE/CiC),并檢測GCRV感染相關(guān)抗病毒因子的表達水平變化。結(jié)果顯示,GCRV感染后,IRF3、IFN-β和IL-1β的表達水平在過表達ScTLR22、CiTLR22和ScE/CiC的CIK細胞中顯著上調(diào)表達;且過表達ScE/CiC的CIK細胞中IFN-β和IL-1β表達水平顯著高于過表達ScTLR22和CiTLR22的CIK(P0.05)。同時,過表達ScE/CiC的CIK細胞對GCRV敏感性顯著低于過表達CiTLR22的CIK(P0.05)。因此,ScTLR22的胞外識別區(qū)域識別GCRV后誘導(dǎo)IFN-β和IL-1β表達,抵抗GCRV入侵的能力優(yōu)于CiTLR22。綜上所述,赤眼鱒TLR22、MyD88和IRF3均參與了機體的抗GCRV病毒免疫反應(yīng),同時赤眼鱒和草魚TLR22胞外識別區(qū)域的結(jié)構(gòu)差異,導(dǎo)致它們對GCRV的識別能力的不同,影響IFN-β和IL-1β等抗病毒因子的表達,導(dǎo)致不同的抗性表型。本研究結(jié)果有助于從TLRs受體層面解釋草魚和赤眼鱒對GCRV的不同表型性狀。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

原微生物。1996 年，Lemaitre 等最先從果蠅上發(fā)現(xiàn) Toll 樣受體，從而驗證了eway 的 PRR 理論[6]。TLR4 是從人體上分離的第一個 TLRs，因其定位于第 4 號染，因此命名為 TLR4。TLRs 屬于 I 型跨膜蛋白，包括三個部分：N 末端特異性識PAMPs 的富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（Leucine-rich repeat, LRR），跨膜結(jié)構(gòu)域ansmembrane domain, TM)和 C 末端下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的 TIR 結(jié)構(gòu)域（Toll/IL-1 receptain, TIR）[7]（圖 1-1B ）。N 端 LRR 識別結(jié)構(gòu)域呈馬蹄狀，包括 15~20 個 LRR，每LRR 含有 24~29 個氨基酸，N 端 LRRs 具有“LxxLxxLxLxxNxLxxLxxxxFxx”保守區(qū)圖 1-1A），其中 L 為亮氨酸或異亮氨酸（I），纈氨酸（V），蛋氨酸（M）和苯丙氨F）。N 表示天冬氨酸（D），或半胱氨酸（C），絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）；F 表示氨酸。C 端的 LRR 的長度和氨基酸序列保守性低[8]（圖 1-1C）。C 端的 TIR 結(jié)構(gòu) TLRs 識別 PAMPs 后信號傳導(dǎo)的核心元件，其氨基酸序列在物種間保守性較高，三個非常保守的功能區(qū)域 box1（FDAFISY）、box2（GYKLC-RD-PG）和 box3（多基酸環(huán)繞的色氨酸），且研究證明 box1 和 box2 在 TLRs 和具有 TIR 結(jié)構(gòu)域的蛋白作用中發(fā)揮重要作用，而 box3 則通過與細胞骨架相互作用，參與受體的定位[9-10]。

圖 1-2 魚類 TLRs 環(huán)形系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1-2 Circular phylogenetic tree of all known full-length fish TLR amino acid sequences：環(huán)形系統(tǒng)發(fā)育樹使用 MEGA7.0.21 鄰接法（Neighbor Joining）泊松分布模型構(gòu)建ote: MEGA 7.0.21 reconstructed a phylogenetic tree according to the Neighbor Joining method using oisson correction distance model. Only bootstrap values above 70% are indicated.系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建所使用的 TLRs 氨基酸序列 GenBank 登錄號如下：CarassiusgibeTLR2 AGR53440.1); Catla catla (TLR22 AGW43269.2); Ctenopharyngodon idella (TLRGM21642.1; TLR9 DB96920.1; TLR3 ABI64155.1; TLR22 ADX97523.2; TLRHN49762.1;TLR5a AIO11757.1; TLR18 AIB55030.1; TLR5b AIO11758.1); Chiloscylliriseum (TLR3 AHG94983.1); Chionodraco hamatus (TLR9 ACT64129.1; TLCT64127.1); Clarias batrachus (TLR21 AGM39445.1); Cynoglossus semilaevis (TLCL68661.1); Danio rerio (TLR22 NP_001122147.2; TLR6 NP_001124065.1; TLAQ90474.1; TLR4b AAQ90475.1; TLR1 AAI63271.1); Epinephelus coioides (TLEB32453.1; TLR1 AEB32452.1; TLR22 AGA84053.1); Gadus morhua (TLR

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本文編號：2725399