【摘要】：自Wolf和Quimby在1962年建立第一個永生細胞系,即虹鱒魚(Onchorynchus mykiss)性腺細胞系RTG-2,隨后越來越多的魚類細胞系被陸續(xù)建立。截止到2011年,全世界報道的魚類細胞系已有275株,但性腺來源的體細胞系和肌肉來源細胞系十分稀少。魚類性腺體細胞主要包括卵巢的間質(zhì)細胞、顆粒細胞和鞘膜細胞,以及精巢的Sertoli細胞、Leydig細胞等。性腺體細胞系對于生殖細胞正常的分裂、分化和性腺組織的結(jié)構(gòu)組成等方面具有決定性的作用,尤其是近幾年對于生殖干細胞研究的熱潮,使得性腺體細胞的體外培養(yǎng)成為發(fā)展必然。肌肉是魚類主要的食用組織,而肌肉細胞系的建立則為進一步研究魚類肌肉的生長、分化和發(fā)育提供了平臺,也有助于養(yǎng)殖魚類快速生長發(fā)育機制的研究和應(yīng)用。魚類細胞系已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、遺傳學(xué)、基因調(diào)控和功能分析、生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、資源保護等領(lǐng)域。因此,開展魚類細胞培養(yǎng)及細胞系建立的研究具有深遠意義。魚類性別決定和性腺分化機制研究一直是熱點,而相關(guān)的表觀遺傳修飾-DNA甲基化對其調(diào)控作用研究還處于起步階段。無論在海水魚還是淡水魚中,對于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因dnmt3的研究十分匱乏,環(huán)境因子如溫度、外源激素等對于甲基化模式的影響更是知之甚少。而dmrt1基因被認為是迄今唯一保守的性別相關(guān)基因,近年來其在各種魚類雌雄個體差異表達譜研究較多,但其甲基化表觀遺傳修飾在性腺分化中的研究報道還很薄弱。褐牙鲆(Paralichthys olivaceus),是名貴的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種,在相同養(yǎng)殖成本下,雌性個體比雄性個體生長快、體積大,因而其性別決定和分化是國內(nèi)外研究的熱點。然而由于缺少合適的性腺細胞系,其性別相關(guān)形成機制尤其是細胞水平的機理幾乎還是空白。且研究證明褐牙鲆三倍體生長明顯快于二倍體,2010年已成功實現(xiàn)褐牙鲆三倍體誘導(dǎo)并達到批量化,然而到目前為止,還沒有關(guān)于褐牙鲆三倍體肌肉生長發(fā)育機制的任何研究進展,更沒有褐牙鲆三倍體肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)的任何研究報道。本研究首先建立、鑒定了褐牙鲆精巢、卵巢、三倍體褐牙鲆肌肉3個細胞系,并分別對其進行外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,以期將這3種細胞系作為體外遺傳操作模型運用于外源基因載體的應(yīng)用研究。同時,克隆得到褐牙鲆甲基轉(zhuǎn)移酶基因dnmt3a和dnmt3b的cDNA全長。利用雌核發(fā)育褐牙鲆幼魚為材料,通過28oC、雌二醇處理,獲得遺傳雌性(XX)表型雄性或雌性的褐牙鲆。之后檢測了dnmt3a和dnmt3b保守區(qū)域與dmrt1在雌二醇刺激和性逆轉(zhuǎn)褐牙鲆的表達關(guān)聯(lián),以期探討甲基化作用對雄性相關(guān)基因dmrt1的調(diào)控作用。具體內(nèi)容及研究結(jié)果如下:褐牙鲆精巢細胞系、卵巢細胞系,分別命名為POSC和POOC,目前分別傳代到55代和34代。兩細胞系都用DMEM/F12基本培養(yǎng)基,FBS添加量為20%,對于EGF生長因子POSC添加15 ng/ml,POOC添加20 ng/ml。POSC和POOC主要細胞類型均為成纖維樣;線粒體707bp COI序列分析結(jié)果與NCBI褐牙鲆COI序列一致性為99%,證明2種細胞系均來自于褐牙鲆;染色體分析顯示POSC和POOC染色體眾數(shù)都為48,都具有褐牙鲆正常二倍體核型;精巢支持細胞特異抗體Fas-L免疫組化實驗證明POSC主要為精巢支持細胞,POOC對卵巢間質(zhì)特異抗體P450SCC和3β-HSD反應(yīng)呈現(xiàn)陽性,證明POOC為卵巢間質(zhì)細胞;脂質(zhì)體2000分別成功將pEGFP-N3轉(zhuǎn)染到POSC和POOC細胞系,轉(zhuǎn)染效率分別為10%和15%,說明2種細胞系均適宜作為有效的外源基因轉(zhuǎn)化載體,都有望應(yīng)用于體外遺傳操作。三倍體褐牙鲆骨骼肌肌肉細胞系命名為POMSCS(3n),經(jīng)過一年的時間目前已傳代66代。POMSCS(3n)適宜的生長培養(yǎng)基為MEM,添加20%FBS。其細胞類型主要為梭形或紡錘體樣;染色體分析顯示POMSCS(3n)的染色體眾數(shù)為72,具有褐牙鲆正常三倍體核型;肌衛(wèi)星特異標記基因pax7b RT-PCR擴增和Desmin特異抗體免疫組化實驗均證明POMSCS(3n)為骨骼肌肌衛(wèi)星細胞;通過利用含2%馬血清的分化培養(yǎng)基DM誘導(dǎo)POMSCS(3n)細胞分化,再利用DAPI染核發(fā)現(xiàn),分化組(DM培養(yǎng)基)相對于對照組(GM培養(yǎng)基)含有較多的2核甚至3-4核的多核纖維樣細胞,證實POMSCS(3n)細胞具有分化潛能,且分化能力強;同樣脂質(zhì)體2000成功將pEGFP-N3轉(zhuǎn)染到該細胞系,轉(zhuǎn)染效率高達20%,說明該細胞系適宜成為有效的外源基因載體,有望成為遺傳操作的有利工具�？寺～@得褐牙鲆dnmt3a和dnmt3b基因cDNA全長,分別得到dnmt3a基因4個轉(zhuǎn)錄本,dnmt3b基因3個轉(zhuǎn)錄本,轉(zhuǎn)錄本之間相似性較高,都具有甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域PWWP。以雌核發(fā)育褐牙鲆幼魚為材料,通過雌二醇(E2)和高溫28oC處理分別得到100%遺傳雌表型雌褐牙鲆和100%遺傳雌表型雄性逆轉(zhuǎn)褐牙鲆,與預(yù)期結(jié)果一致。分析E2處理和28oC處理條件下,dmrt1與dnmt3a和dnmt3b表達模式,發(fā)現(xiàn)dmrt1與dnmt3a和dnmt3b表達有關(guān)聯(lián),且dnmt3a與dmrt1關(guān)系更為密切,暗示雄性相關(guān)基因dmrt1基因表達受甲基轉(zhuǎn)移酶影響,進一步推測褐牙鲆性別決定和分化過程受甲基化作用調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【圖文】：

X/XY 性別決定系統(tǒng)魚類的性別決定和性腺（精巢或卵巢）分化示意圖 (梅潔和桂建Fig1-1 Diagram of sex determination and gonad (testis or ovary) differentiation for fiswith XX/XY sex-determining system

圖 1-2 魚類溫度依賴型性別決定模式2 Patterns of temperature-dependent sex determination (TSD) in fish (Ospina-Alvarez et al.

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本文編號：2719814