【摘要】：對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒病(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis,IHHN)為對蝦主要病毒病之一,近些年,IHHNV流行范圍遍布全球各地,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。IHHHV敏感宿主是細(xì)角濱對蝦和凡納濱對蝦,對細(xì)角濱對蝦引起急性感染和高死亡率,對凡納濱對蝦可導(dǎo)致慢性矮小殘缺綜合癥(RDS),對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將IHHNV列為須向其申報的甲殼類重要疾病之一。目前,IHHNV在流行病學(xué)和診斷方面受到重視,但其致病機(jī)理鮮有報道。本文重點(diǎn)著力于IHHNV衣殼蛋白鰓細(xì)胞膜受體的研究,通過VOPBA、Pull Down、噬菌體隨機(jī)十二肽庫,篩選IHHNV CP受體蛋白,為IHHNV進(jìn)一步研究提供依據(jù)。本文首先提取IHHNV射陽株發(fā)病凡納濱對蝦鰓組織的DNA,根據(jù)GenBank公布的射陽株序列(Accession KF214742)設(shè)計(jì)引物構(gòu)建了 IHHNV CP原核表達(dá)載體。進(jìn)行蛋白原核表達(dá),目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá),用HisTrapTM HP柱純化目的蛋白后,進(jìn)行尿素透析,將透析后的蛋白免疫新西蘭白兔,制備多克隆抗體,三免后抗體效價達(dá)到1:102400。利用勻漿、超速離心分離未感染IHHNV凡納濱對蝦的鰓細(xì)胞膜蛋白,獲得均勻分布的凡納濱對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白條帶。利用VOPBA結(jié)合Pull Down實(shí)驗(yàn)篩選IHHNV CP凡納濱對蝦鰓細(xì)胞膜受體,得到 Signal transducer and activator of transcription(STAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子)、Heat shock protein 90(熱休克蛋白 90)、Prophenoloxidase-2(酚氧化酶原 2 型)、Na+/K+-ATPase alpha subunit(Na+/K+-ATP 酶 a 亞基)、NM23 protein 五種蛋白。將 NM23 基因構(gòu)建到pGEX-4t-1原核表達(dá)載體上,進(jìn)行原核表達(dá),用GST磁珠進(jìn)行純化,進(jìn)行NM23與CP的VOPBA和NM23與CP的GSTPullDown驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,NM23能與IHHNV CP相互作用。利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫淘選IHHNV CP結(jié)合肽,經(jīng)過三次親和→洗脫→擴(kuò)增→親和的循環(huán)淘洗過程,得到6種十二肽可以與IHHNV CP結(jié)合,A(SWSSWVYRDPQT)、B(HSFKWLDSPRLR)、C(SSFKWLDSPRLR)、D(HRSKWVYSDPQR)、E(YWSKWVDWHPQR)、F(SSCKWVDWD*AE),其中 B與C只相差第一個氨基酸,B是H,C是S。D與E均含有SKWV和PQR,可能是IHHNVCP的特征結(jié)合肽。序列A(SWSSWVYRDPQT)與NM23蛋白比對后發(fā)現(xiàn),SW*Y(*為ⅤV或Ⅰ)也可能是IHHNV CP的特征結(jié)合肽.通過之前VOPBA和GST Pull Down驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證明IHHNV CP能與NM23 protein相互作用。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S945.4
【圖文】：

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圖５－８邋ＮＭ２３蛋白的ＶＯＰＢＡ檢測逡逑Ｆｉｇ邋５－８邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＮＭ２３邋ｂｙ邋ｏｎｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ＶＯＰＢＡ邋ｕｓｉｎｇ邋ＩＨＨＮＬａｎｅ邋１．目Ｌ２１－邋ｐＧＥＸ－４＾１邋＋邋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；逡逑Ｌａｎｅ邋２．邋ＢＬ２１－邋ｐＧＥＸ－４＾１－ＮＭ２３邋＋邋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；Ｍ．蛋白邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑Ｌａｎｅ邋１邋衛(wèi)Ｌ２１－ｐＧＥＸ？知－１邋＋邋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；逡逑Ｌａｎｅ邋１邋ＢＬ２１－邋ｐＧＥＸ－４＾１－ＮＭ２３邋十邋ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ；Ｍ．Ｐｒｏ化化邋Ｍａｒｋｅｒ．逡逑２．３邋ＮＭ２３邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ邋Ｄｏｗｎ逡逑洗脫液取等量，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，銀染結(jié)果如圖５－９。ＬａｎｅｋＤａ，相比Ｌａｎｅ邋２有一條帶，與出ＨＮＶ邋ＣＰ位置相符；Ｌａｎｅ邋３和Ｌ位置沒有條帶，排除ＧＳＴ于ＩＨＨＮＶ邋ＣＰ作用的可能；Ｌａｎｅ邋３在相應(yīng)說明洗涂雜蛋白充分。將Ｌａｎｅ邋１邋３５－４０邋ｋＤａ之間的條帶切膠做ＬＩＨＨＮＶＣＰ隨ＧＳＴ－ＮＭ２３蛋白一同洗脫下來，證明二者存在相互作５－４。逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋１邐２邐３邐４逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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4 高學(xué)良,錢e

本文編號：2718018