【摘要】：鎘屬于一種有毒重金屬,能夠造成斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)的多種器官及系統(tǒng)的損傷,嚴(yán)重時(shí)能夠引起蝦的死亡。熱休克蛋白(Heat shock proteins,Hsps)在細(xì)胞中作為一類(lèi)重要的分子伴侶,在生物體抗應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Hsp90是熱休克蛋白研究較為廣泛的一類(lèi)蛋白,也是在細(xì)胞內(nèi)分布最為廣泛的一種蛋白。本實(shí)驗(yàn)室之前克隆獲得Pm Hsp90的基因全長(zhǎng)。為了更好的研究斑節(jié)對(duì)蝦的Pm Hsp90及其分子伴侶Pm Cdc37在鎘應(yīng)激下的分子機(jī)制,本次研究首先通過(guò)RACE技術(shù)克隆表達(dá)Pm Cdc37基因,通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲得Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白,并制備Pm Hsp90和Pm Cdc37相關(guān)抗體;然后為了檢測(cè)原核表達(dá)蛋白的活性,檢測(cè)Pm Hsp90的ATPase活性;在成功干擾了Pm Hsp90和Pm Cdc37的基礎(chǔ)上,通過(guò)注射重組蛋白或者抑制劑統(tǒng)計(jì)在金屬鎘應(yīng)激下斑節(jié)對(duì)蝦的累計(jì)死亡率;最后檢測(cè)了上述處理樣品中血淋SOD的酶活和MDA的含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Pm Hsp90和Pm Cdc37可以影響斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)SOD的活力。為了進(jìn)一步研究SOD在鎘應(yīng)激下的功能,通過(guò)體內(nèi)注射重組蛋白或者RNA干擾Pm SOD后,檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦抗鎘應(yīng)激的能力。鎘應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)斑節(jié)對(duì)蝦產(chǎn)生大量活性氧,對(duì)蛋白激酶的穩(wěn)定性和活性造成影響,Hsp90/Cdc37能維持蛋白激酶的活性和功能,增強(qiáng)機(jī)體修復(fù)能力。目前還沒(méi)有關(guān)于Hsp90/Cdc37對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦抗鎘應(yīng)激氧化損傷修復(fù)機(jī)制的研究。本研究擬采用RACE技術(shù)、原核表達(dá)技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、注射重組蛋白技術(shù)對(duì)Hsp90/Cdc37保護(hù)斑節(jié)對(duì)蝦抗鎘應(yīng)激氧化損傷作用機(jī)制進(jìn)行研究,從m RNA水平、蛋白水平、酶活性水平以及致死率方面揭示Hsp90/Cdc37抗鎘應(yīng)激的作用機(jī)理及Cdc37、Hsp90和抗氧化酶相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系。研究成果豐富了熱休克蛋白家族在斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)的研究,也可為提高蝦類(lèi)免疫能力提供一定的理論支撐。具體獲得的研究成果如下:(1)首先獲得了Pm Cdc37得全長(zhǎng),Pm Cdc37 c DNA全長(zhǎng)2523bp,包含29 bp的5’-UTR、769 bp 3’-UTR和一個(gè)編碼351個(gè)氨基酸的1053 bp開(kāi)放閱讀框。通過(guò)多重序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析,發(fā)現(xiàn)Pm Cdc37在進(jìn)化關(guān)系中保守型不高,各組織分布定量結(jié)果顯示,Pm Cdc37在斑節(jié)對(duì)蝦各組織中均有分布,而且在肝胰腺和血淋巴中表達(dá)量較高。(2)成功構(gòu)建PET30a-Pm Hsp90和PET21a-Pm Cdc37重組質(zhì)粒,體外誘導(dǎo)表達(dá)Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白并純化,將純化的蛋白免疫兔子制備相應(yīng)的多克隆抗體;為了檢測(cè)原核表達(dá)蛋白的體外活性,通過(guò)檢測(cè)Pm Hsp90的ATPase活性及Pm Hsp90加入Pm Cdc37后的ATPase活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Pm Cdc37可以降低Pm Hsp90 ATPase的活性,該實(shí)驗(yàn)表明原核表達(dá)出Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白在體外具有蛋白活性。我們從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)出斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)Pm Cdc37與Pm Hsp90的結(jié)合位點(diǎn)可能與在高等生物中研究的一致,Pm Cdc37是結(jié)合Pm Hsp90的N端的ATP結(jié)合位點(diǎn)。(3)為了驗(yàn)證Pm Hsp90和Pm Cdc37在鎘應(yīng)激下的表達(dá)變化情況,本論文在m RNA水平驗(yàn)證了斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺和血淋巴組織的表達(dá)變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示在m RNA水平上Pm Hsp90和Pm Cdc37均有顯著性升高,在蛋白水平檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦的血淋巴中的蛋白表達(dá)水平也有明顯的升高。說(shuō)明Pm Hsp90和Pm Cdc37在斑節(jié)對(duì)蝦中抗鎘應(yīng)激中發(fā)揮著作用。在此結(jié)論基礎(chǔ)上,我們?cè)诎吖?jié)對(duì)蝦體內(nèi)通過(guò)注射si RNA和可以干擾Pm Hsp90和Pm Cdc37相結(jié)合的天然化學(xué)產(chǎn)物雷公滕紅素以及注射加有穿刺肽的Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白注射重組蛋白的方法檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦在鎘應(yīng)激下的死亡率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注射重組蛋白的實(shí)驗(yàn)組可以減緩斑節(jié)對(duì)蝦的死亡,而抑制或者干擾Pm Hsp90和Pm Cdc37加速斑節(jié)對(duì)蝦的死亡,該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Pm Hsp90和Pm Cdc37可以幫助斑節(jié)對(duì)蝦抵御金屬鎘的應(yīng)激。(4)研究表明金屬鎘能夠干擾生物體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而對(duì)生物體造成不利。為了探討Pm Hsp90和Pm Cdc37抵御鎘應(yīng)激是否與氧化還原途徑相關(guān)。本論文檢測(cè)在干擾或注射重組蛋白Pm Hsp90和Pm Cdc37后在鎘應(yīng)激下血淋巴中SOD酶活和MDA的含量指標(biāo),發(fā)現(xiàn)注射重組蛋白Pm Hsp90和Pm Cdc37可以增強(qiáng)SOD酶活力,抑制表達(dá)Pm Hsp90和Pm Cdc37后,斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)的SOD酶活力減弱。為了進(jìn)一步研究SOD與鎘應(yīng)激的關(guān)系,檢測(cè)了在鎘應(yīng)激后Pm SOD的m RNA的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)Pm SOD在肝胰腺和血淋巴中的表達(dá)量均是先突然升高隨后降低。通過(guò)注射重組蛋白和RNA干擾抑制Pm SOD表達(dá),檢測(cè)在鎘應(yīng)激下斑節(jié)對(duì)蝦的累計(jì)死亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Pm SOD對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦在抵御鎘應(yīng)激下也起到一定的防御作用。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 Hsp90 單體結(jié)構(gòu)示意圖裂周期蛋白（cell division cycle protein，Cdc）Cdc37 最初是在3]，在非允許的溫度下，Cdc37 發(fā)生基因突變，使得細(xì)胞分種之間進(jìn)化水平上 Cdc37 基因的氨基酸序列保守性較差，人守性只有 20%的同源性[24]，卻是一個(gè)功能上相對(duì)保守基因，

圖 1-2 Cdc37 結(jié)構(gòu)示意圖7 兩者結(jié)合表面主要通過(guò)疏水作用力相互作用。研90 相結(jié)合，需要其他一系列共分子伴侶與其協(xié)相結(jié)合，再通過(guò)與 ATP 結(jié)合和水解提供能量，（如圖 1-3）：未與 ATP 相結(jié)合的 Hsp90 處于開(kāi)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉芳;孫昊鵬;尤啟冬;;靶向Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用小分子抑制劑的研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年03期

2 張入峰;宋金遠(yuǎn);李鵬;陸舟;嚴(yán)潔;吳燁;高R

本文編號(hào)：2715129