【摘要】：我國是淡水珍珠生產大國,產量占全世界淡水珍珠總產量的95%以上,但是大型優(yōu)質珍珠稀缺,產量較低,很難滿足國際及國內珍珠市場的需求。我國淡水資源豐富,多年來生產中以外套膜無核珍珠養(yǎng)殖為主,但由于外套膜較薄,育珠空間受限,不易于培養(yǎng)大型珍珠。而內臟團空間較大,可以植入直徑較大的珠核,縮短育珠周期,有利于培養(yǎng)大型珍珠,增加經濟效益。但是由于淡水貝類是開放式循環(huán)系統(tǒng),內臟團育珠部位靠近胃、腎、性腺等臟器,所產珍珠不如外套膜所產珍珠光澤好。本課題組長期以來針對如何在內臟團培育出大型優(yōu)質珍珠而開展了不同層次的研究,對內臟團育珠的生理生化條件、插核部位、免疫反應以及鈣代謝相關基因的功能等多方面的探索。三角帆蚌作為我國特有的主要淡水育珠蚌,在珍珠產地廣為養(yǎng)殖。由于珍珠的主要成分是Ca CO3,因此加強對三角帆蚌鈣代謝相關生物過程以及功能基因的研究具有重要意義。近年來隨著生物分子技術的發(fā)展成熟,為各物種的功能基因研究提供了實驗平臺。但是目前軟體動物的基因數(shù)據(jù)信息較為缺乏,海洋貝類的研究相對豐富一些,但是由于水環(huán)境的差異較大,淡水貝類的基因與可供參考的海洋貝類也有較大差異,長期以來拖緩了淡水貝類功能基因的研究。隨著新一代測序技術的發(fā)展推廣,轉錄組結合數(shù)字基因表達譜測序技術能夠為無參考基因組信息的物種提供高通量數(shù)據(jù)分析。本研究采取三角帆蚌外套膜前、中、后部、內臟團、性腺、血淋巴6處與育珠相關組織,提取總RNA經檢測合格后富集m RNA,經反轉錄成c DNA加測序接頭構建文庫,經檢測合格后經Illumina Hi Seq2000進行測序。測序得到的原始序列經過濾后得到clean reads,拼接組裝成257457條Unigene,經7大數(shù)據(jù)庫比對注釋出223345個基因,通過GO功能顯著性富集和KEGG Pathway顯著性分析篩選出156個與鈣代謝相關的同源比對率較高的基因。選取200只體型差異較小的2齡三角帆蚌,隨機選取20只為對照組,對其余180只實驗組用蚌的外套膜和內臟團各插一粒直徑3mm的珠核加一個外套膜小片,在同一水域進行常規(guī)養(yǎng)殖。分別各取對照組和插核后第5d、20d、50d、90d的5只蚌,取其外套膜和內臟團育珠部位的組織進行RNA抽提,經檢測合格后用于DGE測序。獲得10個clean reads 7M以上的DGE文庫,與轉錄組注釋序列mapping率都在90%以上,數(shù)據(jù)質量較高滿足后續(xù)生物信息分析要求。通過基因差異表達分析、GO功能顯著性富集分析和KEGG顯著性分析,從轉錄組篩選出的156與鈣代謝相關中篩選到58個表達差異顯著的基因,對這58個基因進行不同育珠時期表達變化趨勢分析,總結鈣代謝相關基因與珍珠形成的表達分析。EF-hand基因是一類與鈣代謝功能十分相關的基因,本研究在轉錄組和DGE分析中找到7個EF-hand基因。首先對這7個基因進行氨基酸多序列比對和進化樹分析,找出其相互之間的相似關系。挑選了其中的包含EF-hand鈣結合結構域1(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)基因進行c DNA序列克隆并對其核苷酸序列和氨基酸序列進行生物信息學分析。對EF-hand家族的7個基因進行不同育珠時期的表達分析及對EFCB1基因進行各組織表達分析。結果發(fā)現(xiàn)EF-hand基因在外套膜和內臟團組織中表達差異顯著,推測這兩個組織中珍珠形成基因表達模式差異較大。在不同育珠時間的表達差異有所不同,沒有找到統(tǒng)一的表達變化模式。更多功能的發(fā)現(xiàn)需要更深層次和多方面的研究,通過對關鍵基因的表達調控來影響珍珠質的沉積。本研究構建的轉錄組數(shù)據(jù)平臺以及10個DGE文庫為三角帆蚌提供了豐富的基因數(shù)據(jù)信息,為后續(xù)更多功能基因的研究探索以及珍珠形成的分子機理研究奠定了基礎,通過更多分子水平的研究和科研力量的投入將最終在三角帆蚌內臟團培育出大型優(yōu)質珍珠,加快我國珍珠產業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 文庫構建流程和原理圖Fig .1-1 Library building process and principle質量評估HiSeqTM2000 的堿基質量值和測序錯誤率分別用 Qphred

信息分析流程圖

【參考文獻】

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本文編號：2715167