【摘要】：我國(guó)是淡水珍珠生產(chǎn)大國(guó),產(chǎn)量占全世界淡水珍珠總產(chǎn)量的95%以上,但是大型優(yōu)質(zhì)珍珠稀缺,產(chǎn)量較低,很難滿足國(guó)際及國(guó)內(nèi)珍珠市場(chǎng)的需求。我國(guó)淡水資源豐富,多年來(lái)生產(chǎn)中以外套膜無(wú)核珍珠養(yǎng)殖為主,但由于外套膜較薄,育珠空間受限,不易于培養(yǎng)大型珍珠。而內(nèi)臟團(tuán)空間較大,可以植入直徑較大的珠核,縮短育珠周期,有利于培養(yǎng)大型珍珠,增加經(jīng)濟(jì)效益。但是由于淡水貝類是開放式循環(huán)系統(tǒng),內(nèi)臟團(tuán)育珠部位靠近胃、腎、性腺等臟器,所產(chǎn)珍珠不如外套膜所產(chǎn)珍珠光澤好。本課題組長(zhǎng)期以來(lái)針對(duì)如何在內(nèi)臟團(tuán)培育出大型優(yōu)質(zhì)珍珠而開展了不同層次的研究,對(duì)內(nèi)臟團(tuán)育珠的生理生化條件、插核部位、免疫反應(yīng)以及鈣代謝相關(guān)基因的功能等多方面的探索。三角帆蚌作為我國(guó)特有的主要淡水育珠蚌,在珍珠產(chǎn)地廣為養(yǎng)殖。由于珍珠的主要成分是Ca CO3,因此加強(qiáng)對(duì)三角帆蚌鈣代謝相關(guān)生物過(guò)程以及功能基因的研究具有重要意義。近年來(lái)隨著生物分子技術(shù)的發(fā)展成熟,為各物種的功能基因研究提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。但是目前軟體動(dòng)物的基因數(shù)據(jù)信息較為缺乏,海洋貝類的研究相對(duì)豐富一些,但是由于水環(huán)境的差異較大,淡水貝類的基因與可供參考的海洋貝類也有較大差異,長(zhǎng)期以來(lái)拖緩了淡水貝類功能基因的研究。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展推廣,轉(zhuǎn)錄組結(jié)合數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)能夠?yàn)闊o(wú)參考基因組信息的物種提供高通量數(shù)據(jù)分析。本研究采取三角帆蚌外套膜前、中、后部、內(nèi)臟團(tuán)、性腺、血淋巴6處與育珠相關(guān)組織,提取總RNA經(jīng)檢測(cè)合格后富集m RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成c DNA加測(cè)序接頭構(gòu)建文庫(kù),經(jīng)檢測(cè)合格后經(jīng)Illumina Hi Seq2000進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的原始序列經(jīng)過(guò)濾后得到clean reads,拼接組裝成257457條Unigene,經(jīng)7大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋出223345個(gè)基因,通過(guò)GO功能顯著性富集和KEGG Pathway顯著性分析篩選出156個(gè)與鈣代謝相關(guān)的同源比對(duì)率較高的基因。選取200只體型差異較小的2齡三角帆蚌,隨機(jī)選取20只為對(duì)照組,對(duì)其余180只實(shí)驗(yàn)組用蚌的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)各插一粒直徑3mm的珠核加一個(gè)外套膜小片,在同一水域進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)殖。分別各取對(duì)照組和插核后第5d、20d、50d、90d的5只蚌,取其外套膜和內(nèi)臟團(tuán)育珠部位的組織進(jìn)行RNA抽提,經(jīng)檢測(cè)合格后用于DGE測(cè)序。獲得10個(gè)clean reads 7M以上的DGE文庫(kù),與轉(zhuǎn)錄組注釋序列mapping率都在90%以上,數(shù)據(jù)質(zhì)量較高滿足后續(xù)生物信息分析要求。通過(guò)基因差異表達(dá)分析、GO功能顯著性富集分析和KEGG顯著性分析,從轉(zhuǎn)錄組篩選出的156與鈣代謝相關(guān)中篩選到58個(gè)表達(dá)差異顯著的基因,對(duì)這58個(gè)基因進(jìn)行不同育珠時(shí)期表達(dá)變化趨勢(shì)分析,總結(jié)鈣代謝相關(guān)基因與珍珠形成的表達(dá)分析。EF-hand基因是一類與鈣代謝功能十分相關(guān)的基因,本研究在轉(zhuǎn)錄組和DGE分析中找到7個(gè)EF-hand基因。首先對(duì)這7個(gè)基因進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析,找出其相互之間的相似關(guān)系。挑選了其中的包含EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域1(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)基因進(jìn)行c DNA序列克隆并對(duì)其核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。對(duì)EF-hand家族的7個(gè)基因進(jìn)行不同育珠時(shí)期的表達(dá)分析及對(duì)EFCB1基因進(jìn)行各組織表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EF-hand基因在外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織中表達(dá)差異顯著,推測(cè)這兩個(gè)組織中珍珠形成基因表達(dá)模式差異較大。在不同育珠時(shí)間的表達(dá)差異有所不同,沒(méi)有找到統(tǒng)一的表達(dá)變化模式。更多功能的發(fā)現(xiàn)需要更深層次和多方面的研究,通過(guò)對(duì)關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控來(lái)影響珍珠質(zhì)的沉積。本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)平臺(tái)以及10個(gè)DGE文庫(kù)為三角帆蚌提供了豐富的基因數(shù)據(jù)信息,為后續(xù)更多功能基因的研究探索以及珍珠形成的分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ),通過(guò)更多分子水平的研究和科研力量的投入將最終在三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)培育出大型優(yōu)質(zhì)珍珠,加快我國(guó)珍珠產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 文庫(kù)構(gòu)建流程和原理圖Fig .1-1 Library building process and principle質(zhì)量評(píng)估HiSeqTM2000 的堿基質(zhì)量值和測(cè)序錯(cuò)誤率分別用 Qphred

信息分析流程圖

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 羅文;楊受保;丁盈;弭忠祥;鄭大恒;;三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)珍珠形成初期鈣代謝的特征分析[J];海洋與湖沼;2010年06期

2 段翠蘭;陳光蕓;陳靜;鄒勇;;中國(guó)珍珠研究概論[J];科學(xué)養(yǎng)魚;2012年02期

3 錢偉平,林國(guó)星,許梓榮;Ca~(2+)在三角帆蚌體內(nèi)沉積效應(yīng)的研究[J];水利漁業(yè);2005年01期

4 施志儀;楊顯祥;陳曉武;李勇;;三角帆蚌alpha-2巨球蛋白cDNA全長(zhǎng)的克隆及表達(dá)特征[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2008年04期

5 謝紹河;;淡水有核珍珠大面積養(yǎng)殖技術(shù)研究[J];廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

6 李文娟;施志儀;郝瑩瑩;韓健;靳雨麗;葉顯峰;;運(yùn)用微電極技術(shù)測(cè)定三角帆蚌外套膜Ca~(2+)流量的研究[J];水生生物學(xué)報(bào);2011年03期

7 韓健;李文娟;施志儀;郝瑩瑩;靳雨麗;;三角帆蚌Nacrein基因克隆、蛋白提純及其對(duì)珍珠晶體成型的影響[J];生物技術(shù)通報(bào);2010年12期

8 孟凡超;夏志強(qiáng);曾長(zhǎng)英;王文泉;;數(shù)字化表達(dá)譜差異分析方法-DGE-P[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年02期

9 祁云霞;劉永斌;榮威恒;;轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù):RNA-Seq及其應(yīng)用[J];遺傳;2011年11期

10 蒙釗美，張勤奮，李有寧，邢孔武;黑珠母貝的核位解剖及其插核育珠初步研究[J];中國(guó)水產(chǎn)科學(xué);1994年01期

本文編號(hào)：2715167