【摘要】：2014年2-3月,四川樂(lè)山某似鲇高原鰍養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)一種流行性傳染病,死亡率達(dá)30%,主要臨床特征為體表褪色,皮膚多處潰瘍,腹部出血,鰓絲充血、腫脹與斷裂等。為明確其病因,本研究在病理學(xué)檢查的基礎(chǔ)上,開(kāi)展了病原學(xué)的研究�；疾◆~(yú)剖檢見(jiàn)血色腹水,肝臟腫大,可見(jiàn)壞死灶,腸腔內(nèi)見(jiàn)淡黃色粘液,腦膜充血、出血,脾與腎腫大。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),皮膚壞死,肌間隙增寬、水腫,肌細(xì)胞變性、壞死、溶解；心肌出血；鰓上皮細(xì)胞腫脹、脫落,部分鰓小片增生連成板狀；脾淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,含鐵血黃素沉著；腎間造血組織壞死、出血,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死；肝索結(jié)構(gòu)紊亂,中央靜脈淤血,肝細(xì)胞變性,灶性壞死；腦膜水腫,腦基質(zhì)疏松呈“海綿狀”,神經(jīng)細(xì)胞腫脹,核固縮,小膠質(zhì)細(xì)胞增生。取病魚(yú)的鰓、體表粘液和潰瘍壞死物涂片鏡檢,未發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)與真菌。肝、腎和脾觸片后革蘭氏染色,鏡檢也未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。無(wú)菌條件下,取病魚(yú)的肝、腎和脾組織分別劃線接種LB平板和BHI平板,28℃恒溫培養(yǎng)48 h,未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。將病魚(yú)的肝、腎和脾組織研磨過(guò)濾菌后接種到鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(epithelioma papulossum of carp, EPC),盲傳3代出現(xiàn)壞死,脫落,形成空斑等典型細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),收集細(xì)胞液,離心,取上清液繼續(xù)接種EPC細(xì)胞,分離到一株病毒。將分離病毒液分別腹腔和肌肉注射20尾健康似鲇高原鰍,試驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)與自然發(fā)病魚(yú)相同的癥狀而對(duì)照組無(wú)異常,證實(shí)分離病毒為該病的病原。取細(xì)胞病毒液電鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)病毒顆粒呈單個(gè)或多個(gè)晶格狀排列分布,單個(gè)病毒顆粒為正六邊形,對(duì)稱20面體,對(duì)角線直徑約103±7nm,與虹彩病毒顆粒形態(tài)相似。分離病毒在EPC細(xì)胞中增殖,其TCID50值能達(dá)到1053.4/0.1mL,用BrdU處理分離病毒,病毒滴度下降了4.4個(gè)單位,病毒分別經(jīng)過(guò)乙醚、酸、堿、胰蛋白酶和熱處理后,其TCID50均下降2個(gè)單位以上,表明病毒粒子具有囊膜,對(duì)酸、堿、熱和胰蛋白酶敏感。合成一對(duì)虹彩病毒主要衣殼蛋白(maior capsid protein, MCP)基因的引物(5'-GAC TTG GCC ACT TAT GAC-3',5'-GTC TCT GGA GAA GAA GAA-3'),對(duì)出現(xiàn)CPE的細(xì)胞及自然發(fā)病魚(yú)的內(nèi)臟器官進(jìn)行PCR檢測(cè),均能擴(kuò)增出約500bp的特異性條帶,擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后在GenBank中進(jìn)行NCBI-Blast比對(duì),發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增序列與蛙病毒屬病毒的同源性最高,達(dá)97%以上。為進(jìn)一步明確分離病毒的分類地位,分別設(shè)計(jì)蛙病毒DNApol、RNR-α和RNR-β基因的4對(duì)引物對(duì)分離病毒的相應(yīng)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、T-克隆、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析。在基于以上4個(gè)基因序列與GenBank中部分同源性較高的序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上,分離病毒與中國(guó)大鯢蛙病毒(Chinese giant salamander virus CGSV)、蘇黎世側(cè)褶蛙蛙病毒(Zuerich pelophylax collection ranavirus, ZPCR)、梭鱸虹彩病毒(Pike-perch iridovirus, PPIV)和蛙病毒3型(Frog virus 3, FV3)等聚類,其中與CGSV聚為一支。在聯(lián)合以上4個(gè)基因構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上,分離病毒更接近于兩棲類蛙病毒亞群。本研究利用EPC細(xì)胞從患病似鲇高原鰍體內(nèi)分離到一株病毒,經(jīng)人工感染試驗(yàn),形態(tài)學(xué)、理化性質(zhì)和分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)似鲇高原鰍傳染性潰瘍癥的病原是蛙病毒屬成員,這是首次報(bào)道蛙病毒可自然感染似鲇高原鰍并致死。
【圖文】：

圖２－５魄小片腫脹，呼吸上皮細(xì)胞腫脹邋圖２－６夬小片上皮細(xì)胞嚴(yán)重增生，相鄰鮑小逡逑（★），與毛細(xì)血管分離比Ｅ４００邐片姇合（★），炎性細(xì)胞浸潤(rùn)Ｈ．Ｅ２００逡逑Ｆｉｇ．２－５邋ｓｗｅｌｌｉｎｇ邋ｏｆ邋TBｉｌｌ邋ａｎｄ邋ｉ＊ｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ邐Ｆｉｇ．２－６邋ｄｅｅｐｌｙ邋ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ邋ｏｆ邋ｇｉｌｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ逡逑ｅｐｉｔｈｅｌ山ｍ邋（★），ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ｃａｐｉｌｌａｒｙ邋（★），ｆｕｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｇｉｌｌ邋ｌａｍｅｌｌａｅｓ邋Ｈ．Ｅ邋２００逡逑ｌａｙｅｒ邋Ｈ．Ｅ邋４００逡逑２５逡逑

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【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2710343