【摘要】：近年來,東南亞對蝦養(yǎng)殖場已報道了越來越多的對蝦生長緩慢的現(xiàn)象,這些養(yǎng)殖場的對蝦嚴重地感染了一種微孢子蟲,即蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP),該寄生蟲是2009年Tourtip等在泰國養(yǎng)殖的生長緩慢的班節(jié)對蝦(Penaeus monodon)中最早發(fā)現(xiàn)。EHP為胞內(nèi)寄生蟲,屬于微孢子蟲科、腸胞蟲屬,繁殖方式是在宿主肝胰腺小管上皮細胞的細胞質(zhì)內(nèi)進行復(fù)制。EHP感染并沒有明顯的臨床癥狀,對于該現(xiàn)象的診斷主要通過組織學(xué)觀察、PCR法、地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交法以及LAMP檢測方法。為了不僅能夠定性檢測,也能夠定量檢測,因此本實驗室建立了SYBR Green I實時熒光定量PCR用于檢測EHP。經(jīng)實驗證明建立的此方法具備了檢測方法的標(biāo)準(zhǔn),可以用來定量的檢測實際樣品,為EHP的檢測和防控提供了又一技術(shù)手段。然而在定量檢測的方法中,Taqman探針法更能夠被廣泛的接受,其技術(shù)原理決定了該方法的高特異性,能夠有效的避免反應(yīng)過程中的非特異性擴增,其準(zhǔn)確度也大大的提高了,無論在水生生物還是其他生物的病原檢測中均得到了廣泛的認可。并且在蝦類病原的監(jiān)測防控方法的收錄中,OIE檢測標(biāo)準(zhǔn)更傾向于將Taqman探針作為標(biāo)準(zhǔn)方法。因此,為了更加精確地定量檢測EHP,本文建立了Taqman探針熒光定量PCR檢測技術(shù),并用該技術(shù)檢測了從各地區(qū)采集的對蝦樣品。本文建立的蝦肝腸胞蟲Taqman探針熒光定量PCR檢測方法,是針對6.1×101—6.1×108 copies/μL的EHP SSU rDNA標(biāo)準(zhǔn)品,從檢測結(jié)果表明該方法的線性關(guān)系較好,并且具有較好的組間和組內(nèi)重復(fù)性。通過對實際樣品檢測來比較本研究建立的方法、套式PCR和SYBR Green I qPCR-EHP這三種方法。由實驗結(jié)果可以看出,Taqman qPCR-EHP比套式PCR靈敏度高7.6±4.2倍,比SYBR Green I qPCR-EHP高1.3±0.2倍。Taqman qPCR-EHP陽性檢出率(93.5%)明顯高于套式PCR陽性檢出率(77.4%),也略高于SYBR Green I qPCR-EHP陽性檢出率(88.7%);與Taqman qPCR-EHP相比,套式PCR和SYBR Green I q PCR-EHP的診斷特異性為100%,診斷敏感性分別為82.8%和96.6%,這表明Taqman qPCR-EHP有更高的診斷敏感性。Taqman qPCR-EHP和SYBR Green I qPCR-EHP定量結(jié)果的相關(guān)性較高,數(shù)值可比性好。本論文還對采集自天津、浙江的四批對蝦樣品進行逐尾體長,體重測量,計算出體質(zhì)指數(shù)(BMI),抽提各尾對蝦肝胰腺的總DNA樣品,利用Taqman qPCR-EHP檢測肝胰腺DNA樣品中的EHP載量,結(jié)果表明,在來自天津的樣品中,EHP載量與BMI存在負相關(guān)性,即EHP影響對蝦的生長狀態(tài),這與我們采用SYBR Green I熒光定量PCR方法所得出的結(jié)論類似,而且Taqman qPCR-EHP方法還直接證明了對EHP采取某種治療手段的前后兩次采集的樣品中的EHP載量出現(xiàn)明顯的下降,治療后的EHP載量的對數(shù)平均值下降到治療前的(48.4±39.4)%,說明建立的qPCR方法能用于EHP治療效果的評價。對采集自天津、浙江和山東等養(yǎng)殖場的5個凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)群體的442尾個體進行蝦肝腸孢蟲(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的Taqman探針熒光定量PCR檢測,并測量各群體每尾對蝦的生物學(xué)體長和體重。引入醫(yī)學(xué)上的勞累爾(Rohrer)體重指數(shù)(Ponderal index,Pi,W/L3)關(guān)系建立對蝦體重(W)和體長(L)關(guān)系函數(shù)。結(jié)果表明,4個凡納濱對蝦的EHP陽性群體(平均體長5.37±1.19 cm)的體重指數(shù)Pi均值為(5.19±0.26)×10-3 g/cm3,EHP陰性群體的凡納濱對蝦群體(平均體長2.49±0.21)為(7.96±0.51)×10-3 g/cm3,根據(jù)Pi=a L(b-3)的函數(shù)矯正EHP陰性和陽性群體的體長差異引起的Pi差值后,同等體長下EHP陽性群體的Pi值為陰性群體的(70.5±8.7)%,表明同樣大小的個體,EHP陽性群體的平均體重比陰性群體低三成;EHP陽性群體中凡納濱對蝦體長和體重的變異系數(shù)是EHP陰性群體的2.39±0.93和2.05±0.86倍,表現(xiàn)為EHP陽性的對蝦群體個體大小不均勻;EHP陽性群體體重偏差率是EHP陰性群體的2.34—3.45倍,體長相同時,EHP陽性的體重波動變大。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文17圖2-2 蝦肝腸胞蟲SSU rDNATaqman qPCR特異性分析的擴增曲線Fig. 2-2 Amplification curve of specificity analysis of the Taqman qPCR for the SSU rDNA ofmicrosporidian E. hepatopenaei圖3 蝦肝腸胞蟲SSU rDNATaqman qPCR擴增產(chǎn)物的電泳M：DL2000；1：EHP的PCR檢測為陽性的凡納濱對蝦樣品總DNA，N：陰性對照Fig. 3 Gel electrophoresis of Taqman qPCR products of Microsporidian E. hepatopenaeiM: DL2000; 1: Total DNA of L. vannamei infected with EHP; N: Negative control

Fig. 2-2 Amplification curve of specificity analysis of the Taqman qPCR for the SSU rDNA ofmicrosporidian E. hepatopenaei圖3 蝦肝腸胞蟲SSU rDNATaqman qPCR擴增產(chǎn)物的電泳M：DL2000；1：EHP的PCR檢測為陽性的凡納濱對蝦樣品總DNA，N：陰性對照Fig. 3 Gel electrophoresis of Taqman qPCR products of Microsporidian E. hepatopenaeiM: DL2000; 1: Total DNA of L. vannamei infected with EHP; N: Negative control
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S945.4

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1 林惠山;戚雋淵;喬燕平;;凡納濱對蝦高產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)優(yōu)化技術(shù)探討[J];水產(chǎn)科技情報;2006年04期

2 衣萌萌;于赫男;林小濤;許忠能;周小壯;;密度脅迫下凡納濱對蝦的行為與生理變化[J];暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2012年01期

3 周歧存,丁q，

本文編號：2705724