【摘要】：近年來(lái),東南亞對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)已報(bào)道了越來(lái)越多的對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象,這些養(yǎng)殖場(chǎng)的對(duì)蝦嚴(yán)重地感染了一種微孢子蟲(chóng),即蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP),該寄生蟲(chóng)是2009年Tourtip等在泰國(guó)養(yǎng)殖的生長(zhǎng)緩慢的班節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)中最早發(fā)現(xiàn)。EHP為胞內(nèi)寄生蟲(chóng),屬于微孢子蟲(chóng)科、腸胞蟲(chóng)屬,繁殖方式是在宿主肝胰腺小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。EHP感染并沒(méi)有明顯的臨床癥狀,對(duì)于該現(xiàn)象的診斷主要通過(guò)組織學(xué)觀察、PCR法、地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交法以及LAMP檢測(cè)方法。為了不僅能夠定性檢測(cè),也能夠定量檢測(cè),因此本實(shí)驗(yàn)室建立了SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)EHP。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明建立的此方法具備了檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn),可以用來(lái)定量的檢測(cè)實(shí)際樣品,為EHP的檢測(cè)和防控提供了又一技術(shù)手段。然而在定量檢測(cè)的方法中,Taqman探針?lè)ǜ軌虮粡V泛的接受,其技術(shù)原理決定了該方法的高特異性,能夠有效的避免反應(yīng)過(guò)程中的非特異性擴(kuò)增,其準(zhǔn)確度也大大的提高了,無(wú)論在水生生物還是其他生物的病原檢測(cè)中均得到了廣泛的認(rèn)可。并且在蝦類病原的監(jiān)測(cè)防控方法的收錄中,OIE檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)更傾向于將Taqman探針作為標(biāo)準(zhǔn)方法。因此,為了更加精確地定量檢測(cè)EHP,本文建立了Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù),并用該技術(shù)檢測(cè)了從各地區(qū)采集的對(duì)蝦樣品。本文建立的蝦肝腸胞蟲(chóng)Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè)方法,是針對(duì)6.1×101—6.1×108 copies/μL的EHP SSU rDNA標(biāo)準(zhǔn)品,從檢測(cè)結(jié)果表明該方法的線性關(guān)系較好,并且具有較好的組間和組內(nèi)重復(fù)性。通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)來(lái)比較本研究建立的方法、套式PCR和SYBR Green I qPCR-EHP這三種方法。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,Taqman qPCR-EHP比套式PCR靈敏度高7.6±4.2倍,比SYBR Green I qPCR-EHP高1.3±0.2倍。Taqman qPCR-EHP陽(yáng)性檢出率(93.5%)明顯高于套式PCR陽(yáng)性檢出率(77.4%),也略高于SYBR Green I qPCR-EHP陽(yáng)性檢出率(88.7%);與Taqman qPCR-EHP相比,套式PCR和SYBR Green I q PCR-EHP的診斷特異性為100%,診斷敏感性分別為82.8%和96.6%,這表明Taqman qPCR-EHP有更高的診斷敏感性。Taqman qPCR-EHP和SYBR Green I qPCR-EHP定量結(jié)果的相關(guān)性較高,數(shù)值可比性好。本論文還對(duì)采集自天津、浙江的四批對(duì)蝦樣品進(jìn)行逐尾體長(zhǎng),體重測(cè)量,計(jì)算出體質(zhì)指數(shù)(BMI),抽提各尾對(duì)蝦肝胰腺的總DNA樣品,利用Taqman qPCR-EHP檢測(cè)肝胰腺DNA樣品中的EHP載量,結(jié)果表明,在來(lái)自天津的樣品中,EHP載量與BMI存在負(fù)相關(guān)性,即EHP影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)狀態(tài),這與我們采用SYBR Green I熒光定量PCR方法所得出的結(jié)論類似,而且Taqman qPCR-EHP方法還直接證明了對(duì)EHP采取某種治療手段的前后兩次采集的樣品中的EHP載量出現(xiàn)明顯的下降,治療后的EHP載量的對(duì)數(shù)平均值下降到治療前的(48.4±39.4)%,說(shuō)明建立的qPCR方法能用于EHP治療效果的評(píng)價(jià)。對(duì)采集自天津、浙江和山東等養(yǎng)殖場(chǎng)的5個(gè)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)群體的442尾個(gè)體進(jìn)行蝦肝腸孢蟲(chóng)(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè),并測(cè)量各群體每尾對(duì)蝦的生物學(xué)體長(zhǎng)和體重。引入醫(yī)學(xué)上的勞累爾(Rohrer)體重指數(shù)(Ponderal index,Pi,W/L3)關(guān)系建立對(duì)蝦體重(W)和體長(zhǎng)(L)關(guān)系函數(shù)。結(jié)果表明,4個(gè)凡納濱對(duì)蝦的EHP陽(yáng)性群體(平均體長(zhǎng)5.37±1.19 cm)的體重指數(shù)Pi均值為(5.19±0.26)×10-3 g/cm3,EHP陰性群體的凡納濱對(duì)蝦群體(平均體長(zhǎng)2.49±0.21)為(7.96±0.51)×10-3 g/cm3,根據(jù)Pi=a L(b-3)的函數(shù)矯正EHP陰性和陽(yáng)性群體的體長(zhǎng)差異引起的Pi差值后,同等體長(zhǎng)下EHP陽(yáng)性群體的Pi值為陰性群體的(70.5±8.7)%,表明同樣大小的個(gè)體,EHP陽(yáng)性群體的平均體重比陰性群體低三成;EHP陽(yáng)性群體中凡納濱對(duì)蝦體長(zhǎng)和體重的變異系數(shù)是EHP陰性群體的2.39±0.93和2.05±0.86倍,表現(xiàn)為EHP陽(yáng)性的對(duì)蝦群體個(gè)體大小不均勻;EHP陽(yáng)性群體體重偏差率是EHP陰性群體的2.34—3.45倍,體長(zhǎng)相同時(shí),EHP陽(yáng)性的體重波動(dòng)變大。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文17圖2-2 蝦肝腸胞蟲(chóng)SSU rDNATaqman qPCR特異性分析的擴(kuò)增曲線Fig. 2-2 Amplification curve of specificity analysis of the Taqman qPCR for the SSU rDNA ofmicrosporidian E. hepatopenaei圖3 蝦肝腸胞蟲(chóng)SSU rDNATaqman qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳M：DL2000；1：EHP的PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的凡納濱對(duì)蝦樣品總DNA，N：陰性對(duì)照Fig. 3 Gel electrophoresis of Taqman qPCR products of Microsporidian E. hepatopenaeiM: DL2000; 1: Total DNA of L. vannamei infected with EHP; N: Negative control

Fig. 2-2 Amplification curve of specificity analysis of the Taqman qPCR for the SSU rDNA ofmicrosporidian E. hepatopenaei圖3 蝦肝腸胞蟲(chóng)SSU rDNATaqman qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳M：DL2000；1：EHP的PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的凡納濱對(duì)蝦樣品總DNA，N：陰性對(duì)照Fig. 3 Gel electrophoresis of Taqman qPCR products of Microsporidian E. hepatopenaeiM: DL2000; 1: Total DNA of L. vannamei infected with EHP; N: Negative control
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S945.4

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3 周歧存,丁q，

本文編號(hào)：2705724