【摘要】：半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國特有的名貴海水養(yǎng)殖魚類,其味道鮮美、口感爽滑、營養(yǎng)豐富,深受廣大消費者喜愛,極具市場經(jīng)濟價值和養(yǎng)殖開發(fā)潛力。然而,高密度、集約化的養(yǎng)殖模式以及環(huán)境污染等原因,致使半滑舌鰨腹水、爛鰭、爛尾等細菌性疾病日益突出,嚴重制約了半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。將傳統(tǒng)選擇育種模式與分子標記輔助選擇育種技術相結合,有利于半滑舌鰨抗性品系的培育,單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)被認為是一種極具應用前景的分子標記技術。本文以半滑舌鰨為研究材料,克隆了半滑舌鰨兩種免疫相關基因Nramp和IL-10,并進行了初步分析研究;利用直接測序法篩選了Nramp基因抗病相關的SNP分子標記,以期為半滑舌鰨抗性品系培育提供技術支持。主要研究結果如下:1.半滑舌鰨免疫相關基因的克隆與初步分析研究利用c DNA末端快速擴增技術,對半滑舌鰨天然抗性相關巨噬細胞蛋白(Natural resistance associated macrophage protein,Nramp)和白細胞介素10(Interleukin 10,IL-10)基因分別進行了克隆,并對其序列結構進行了分析研究。隨后,對半滑舌鰨Nramp和IL-10基因感染哈維氏弧菌前后轉錄組水平的表達分析進行研究;并對半滑舌鰨IL-10基因原核表達進行了初步探索。1)半滑舌鰨Nramp基因克隆與表達分析Nramp屬于膜整合轉運蛋白,具有抑制胞內(nèi)寄生菌侵染、調(diào)節(jié)巨噬細胞抗菌活性等作用。本研究克隆了半滑舌鰨Nramp基因的c DNA序列,該基因全長3717bp,具有16個外顯子,其中開放閱讀框(open reading frame,ORF)為1677 bp,所編碼蛋白含有558個氨基酸,該蛋白具有Nramp家族的典型特征:包括10個跨膜區(qū)(transmembrane,TM)、1個由20個氨基酸殘基組成的胞質(zhì)內(nèi)轉運蛋白特征結構域(consensus transport motif,CTM)。半滑舌鰨Nramp基因其ORF末端有1個類似于脊椎動物Nramp2中的鐵反應控制蛋白結合位點(iron-responsive regulatory-protein-binding sites,IRE)。半滑舌鰨Nramp與其他14個物種的Nramp氨基酸序列同源性在63~91%之間,系統(tǒng)進化分析表明,半滑舌鰨Nramp和所有魚類Nramp聚集為一簇,與其他物種Nramp2的親緣關系較近。實時熒光定量PCR分析表明,Nramp基因在半滑舌鰨脾臟和腎臟中的表達量最高,而在肌肉和性腺中的表達量最低;在哈維氏弧菌感染后的半滑舌鰨腎臟、脾臟和肝臟中表達量呈升高趨勢,而在鰓中則表現(xiàn)為下調(diào)趨勢。2)半滑舌鰨IL-10基因克隆與原核表達IL-10是一種具有廣泛作用的細胞因子,其主要功能是抑制和終止炎癥反應。本研究克隆了半滑舌鰨IL-10基因的c DNA序列,該基因全長935 bp,具有5個外顯子,其ORF為561 bp,所編碼蛋白含有186個氨基酸,包含4個保守的半胱氨酸殘基構成2對二硫鍵,該蛋白具有IL-10家族的特征序列:G-X2-KA-X2-[D,E]-X-D-[ILV]-[FLV]-[FILMV]-X2-[ILMV][EKQR]。半滑舌鰨IL-10與其他15個物種的IL-10氨基酸序列同源性在27~62%之間,系統(tǒng)進化分析表明,半滑舌鰨IL-10與紅鰭東方渶、大西洋鱈、歐洲鱸魚和青斑河豚的親緣關系最近,聚集為一支;而在高等動物中與原雞的親緣關系最近。實時熒光定量PCR分析表明,半滑舌鰨IL-10 m RNA主要在肝臟、心臟、皮膚和腸中表達;在哈維氏弧菌感染后的肝臟和鰓中表達量呈下調(diào)趨勢,而脾臟則表現(xiàn)為升高趨勢。根據(jù)半滑舌鰨IL-10的c DNA序列設計表達引物,利用p EASY原核表達載體試劑盒(p EASY-E1 Expression Kit)構建重組表達質(zhì)粒,經(jīng)測序正確后,將重組質(zhì)粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導重組質(zhì)粒蛋白表達;聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測顯示重組融合蛋白在分子量約21 k D處有明顯目的表達條帶,與預測分子量大小一致,且主要以不可溶的包涵體形式存在;Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)多克隆抗體可與半滑舌鰨IL-10重組融合蛋白有效結合。2.半滑舌鰨免疫相關基因抗病分子標記篩選為篩選半滑舌鰨候選基因Nramp和TLR-9抗病相關的SNP標記,利用直接測序法對233個半滑舌鰨個體(死亡個體68個,存活個體165個)進行了抗病相關SNP標記篩選。首先構建了死亡和存活個體基因池(死亡個體和存活個體各20個),并利用引物對其進行初步掃描;對在死亡和存活個體基因池中初步篩選到的SNP位點,用構成死亡和存活個體基因池的40個個體進行第一次單個體驗證;對于在第一次個體驗證中差異顯著的SNP位點在剩余193個個體中進行第二次單個體驗證。結果顯示,在TLR-9中初步篩選到3個SNP位點,而在Nramp中篩選到15個SNP位點;經(jīng)第一次單個體驗證發(fā)現(xiàn),TLR-9基因的3個SNP位點在死亡和存活個體中無顯著性差異,而Nramp基因中有1個SNP-g.3125位點在存活和死亡個體中呈顯著性差異;對Nramp基因SNP位點進行第二次單個體驗證發(fā)現(xiàn),半滑舌鰨Nramp基因中的SNP-g.3125等位基因(G)和基因型(GG)與半滑舌鰨抗鰻弧菌疾病呈極顯著相關性(P㩳0.01)。因此,Nramp基因該SNP位點可作為半滑舌鰨抗病育種的一個潛在的遺傳標記位點,為半滑舌鰨抗性品系培育的遺傳分子標記提供基礎研究資料。
【圖文】：

提取的半滑舌鰨基因組 DNA 經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖 2-1），所提取的基因組 DNA 條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，，完整性較好。利用 DNA/ RNA 定量儀檢測基因組 DNA，其中 OD260/OD280比值在 1.8~2.0 之間，表明提取的基因組 DNA 質(zhì)量較高；濃度在之間，用 ddH2O 稀釋至 100 ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?

PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖片
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2692831