【摘要】：半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國(guó)特有的名貴海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi),其味道鮮美、口感爽滑、營(yíng)養(yǎng)豐富,深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài),極具市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)潛力。然而,高密度、集約化的養(yǎng)殖模式以及環(huán)境污染等原因,致使半滑舌鰨腹水、爛鰭、爛尾等細(xì)菌性疾病日益突出,嚴(yán)重制約了半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。將傳統(tǒng)選擇育種模式與分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)相結(jié)合,有利于半滑舌鰨抗性品系的培育,單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)被認(rèn)為是一種極具應(yīng)用前景的分子標(biāo)記技術(shù)。本文以半滑舌鰨為研究材料,克隆了半滑舌鰨兩種免疫相關(guān)基因Nramp和IL-10,并進(jìn)行了初步分析研究;利用直接測(cè)序法篩選了Nramp基因抗病相關(guān)的SNP分子標(biāo)記,以期為半滑舌鰨抗性品系培育提供技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下:1.半滑舌鰨免疫相關(guān)基因的克隆與初步分析研究利用c DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),對(duì)半滑舌鰨天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(Natural resistance associated macrophage protein,Nramp)和白細(xì)胞介素10(Interleukin 10,IL-10)基因分別進(jìn)行了克隆,并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析研究。隨后,對(duì)半滑舌鰨Nramp和IL-10基因感染哈維氏弧菌前后轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)分析進(jìn)行研究;并對(duì)半滑舌鰨IL-10基因原核表達(dá)進(jìn)行了初步探索。1)半滑舌鰨Nramp基因克隆與表達(dá)分析Nramp屬于膜整合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具有抑制胞內(nèi)寄生菌侵染、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗菌活性等作用。本研究克隆了半滑舌鰨Nramp基因的c DNA序列,該基因全長(zhǎng)3717bp,具有16個(gè)外顯子,其中開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)為1677 bp,所編碼蛋白含有558個(gè)氨基酸,該蛋白具有Nramp家族的典型特征:包括10個(gè)跨膜區(qū)(transmembrane,TM)、1個(gè)由20個(gè)氨基酸殘基組成的胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特征結(jié)構(gòu)域(consensus transport motif,CTM)。半滑舌鰨Nramp基因其ORF末端有1個(gè)類(lèi)似于脊椎動(dòng)物Nramp2中的鐵反應(yīng)控制蛋白結(jié)合位點(diǎn)(iron-responsive regulatory-protein-binding sites,IRE)。半滑舌鰨Nramp與其他14個(gè)物種的Nramp氨基酸序列同源性在63~91%之間,系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,半滑舌鰨Nramp和所有魚(yú)類(lèi)Nramp聚集為一簇,與其他物種Nramp2的親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,Nramp基因在半滑舌鰨脾臟和腎臟中的表達(dá)量最高,而在肌肉和性腺中的表達(dá)量最低;在哈維氏弧菌感染后的半滑舌鰨腎臟、脾臟和肝臟中表達(dá)量呈升高趨勢(shì),而在鰓中則表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì)。2)半滑舌鰨IL-10基因克隆與原核表達(dá)IL-10是一種具有廣泛作用的細(xì)胞因子,其主要功能是抑制和終止炎癥反應(yīng)。本研究克隆了半滑舌鰨IL-10基因的c DNA序列,該基因全長(zhǎng)935 bp,具有5個(gè)外顯子,其ORF為561 bp,所編碼蛋白含有186個(gè)氨基酸,包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基構(gòu)成2對(duì)二硫鍵,該蛋白具有IL-10家族的特征序列:G-X2-KA-X2-[D,E]-X-D-[ILV]-[FLV]-[FILMV]-X2-[ILMV][EKQR]。半滑舌鰨IL-10與其他15個(gè)物種的IL-10氨基酸序列同源性在27~62%之間,系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,半滑舌鰨IL-10與紅鰭東方渶、大西洋鱈、歐洲鱸魚(yú)和青斑河豚的親緣關(guān)系最近,聚集為一支;而在高等動(dòng)物中與原雞的親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,半滑舌鰨IL-10 m RNA主要在肝臟、心臟、皮膚和腸中表達(dá);在哈維氏弧菌感染后的肝臟和鰓中表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì),而脾臟則表現(xiàn)為升高趨勢(shì)。根據(jù)半滑舌鰨IL-10的c DNA序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物,利用p EASY原核表達(dá)載體試劑盒(p EASY-E1 Expression Kit)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序正確后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒蛋白表達(dá);聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測(cè)顯示重組融合蛋白在分子量約21 k D處有明顯目的表達(dá)條帶,與預(yù)測(cè)分子量大小一致,且主要以不可溶的包涵體形式存在;Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多克隆抗體可與半滑舌鰨IL-10重組融合蛋白有效結(jié)合。2.半滑舌鰨免疫相關(guān)基因抗病分子標(biāo)記篩選為篩選半滑舌鰨候選基因Nramp和TLR-9抗病相關(guān)的SNP標(biāo)記,利用直接測(cè)序法對(duì)233個(gè)半滑舌鰨個(gè)體(死亡個(gè)體68個(gè),存活個(gè)體165個(gè))進(jìn)行了抗病相關(guān)SNP標(biāo)記篩選。首先構(gòu)建了死亡和存活個(gè)體基因池(死亡個(gè)體和存活個(gè)體各20個(gè)),并利用引物對(duì)其進(jìn)行初步掃描;對(duì)在死亡和存活個(gè)體基因池中初步篩選到的SNP位點(diǎn),用構(gòu)成死亡和存活個(gè)體基因池的40個(gè)個(gè)體進(jìn)行第一次單個(gè)體驗(yàn)證;對(duì)于在第一次個(gè)體驗(yàn)證中差異顯著的SNP位點(diǎn)在剩余193個(gè)個(gè)體中進(jìn)行第二次單個(gè)體驗(yàn)證。結(jié)果顯示,在TLR-9中初步篩選到3個(gè)SNP位點(diǎn),而在Nramp中篩選到15個(gè)SNP位點(diǎn);經(jīng)第一次單個(gè)體驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),TLR-9基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)在死亡和存活個(gè)體中無(wú)顯著性差異,而Nramp基因中有1個(gè)SNP-g.3125位點(diǎn)在存活和死亡個(gè)體中呈顯著性差異;對(duì)Nramp基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行第二次單個(gè)體驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),半滑舌鰨Nramp基因中的SNP-g.3125等位基因(G)和基因型(GG)與半滑舌鰨抗鰻弧菌疾病呈極顯著相關(guān)性(P㩳0.01)。因此,Nramp基因該SNP位點(diǎn)可作為半滑舌鰨抗病育種的一個(gè)潛在的遺傳標(biāo)記位點(diǎn),為半滑舌鰨抗性品系培育的遺傳分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)研究資料。
【圖文】：

提取的半滑舌鰨基因組 DNA 經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（見(jiàn)圖 2-1），所提取的基因組 DNA 條帶清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，，完整性較好。利用 DNA/ RNA 定量?jī)x檢測(cè)基因組 DNA，其中 OD260/OD280比值在 1.8~2.0 之間，表明提取的基因組 DNA 質(zhì)量較高；濃度在之間，用 ddH2O 稀釋至 100 ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖片
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2692831