【摘要】：磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)信號通路在增殖、凋亡、存活以及代謝等細胞生物學進程中發(fā)揮著重要的作用。目前,有關(guān)PI3K家族基因的結(jié)構(gòu)和功能在哺乳動物中已取得了一定的進展,但是卻很少有對魚類的PI3K家族基因進行研究。胰島素介導的PI3K信號通路(胰島素受體底物/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B,IRS-PI3K-AKT)是胰島素信號通路中的經(jīng)典通路。在哺乳動物中,已有大量研究表明該信號通路調(diào)控機體的營養(yǎng)代謝活動,促使機體糖原、脂肪和蛋白質(zhì)的合成。目前在魚類中,有關(guān)胰島素對脂代謝研究相對缺乏,并且很少有學者關(guān)注IRS-PI3K-AKT信號通路在魚類脂肪代謝中作用。本論文以黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)為研究對象,研究黃顙魚PI3K家族基因的結(jié)構(gòu)和功能,并結(jié)合IRS-PI3K-AKT信號通路探討胰島素調(diào)控黃顙魚肝臟脂代謝的作用機制。具體包括以下幾個方面:1、黃顙魚pi3ks家族基因的分子克隆及組織表達分析為了初步了解黃顙魚pi3ks家族基因基本特征,本研究采用RACE技術(shù)從黃顙魚中共克隆得到7個不同亞型的pi3k,它們分別是pi3kca、pi3kcb、pi3kcd、pi3kcg、pi3kc2a、pi3kc2b和pi3kc3,全長c DNA序列分別為4585 bp、5881 bp、4036 bp、3786 bp、6350 bp、6030 bp和3552 bp,分別編碼1069、1069、1044、1104、1670、1579和877個氨基酸。氨基酸結(jié)構(gòu)域分析顯示,7個pi3k亞型共分為I、II和III 3類,所有pi3k亞型均包括N端C2結(jié)構(gòu)域、PIK結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域,并且所有保守結(jié)構(gòu)域中,催化結(jié)構(gòu)域相似度最高,而且都包含保守的ATP結(jié)合位點。進化分析顯示7個黃顙魚不同亞型pi3k明顯的分成I、II、III 3類,在I類中又明顯的分成4大枝,并且pi3kcb跟pi3kcd的親緣關(guān)系更相近,并且在進化上黃顙魚與墨西哥脂鯉在硬骨魚類分枝上親緣關(guān)系較近,而與哺乳動物親緣關(guān)系較遠。通過熒光實時定量PCR技術(shù),研究了黃顙魚不同亞型pi3k在不同組織中的基因表達水平。結(jié)果顯示:不同亞型pi3k均在卵巢中表達量最高,pi3kca、pi3kcb、pi3kc2a、pi3kc2b以及pi3kc3廣泛表達于不同組織。而pi3kcd和pi3kcg屬于組織特異性表達,特別是在肝臟、腸道、腎臟、心臟以及鰓中表達量非常低。2、黃顙魚pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3啟動子克隆及其功能研究本實驗以第一部分實驗獲得PI3K的c DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物,利用hitail PCR方法進行pi3k啟動子區(qū)域克隆,最后共得到pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的5’上游啟動子序列長度分別為360 bp、1848 bp和367 bp。生物信息學分析顯示pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的核心啟動子區(qū)結(jié)構(gòu)不一樣,其中pi3kca和pi3kc2b包含Cp G島,但不存在CAAT和TATA盒。而pi3kc3包含CAAT和TATA盒,但不存在Cp G島。同時,根據(jù)Mat Inspector和JASPAR數(shù)據(jù)庫,我們還預(yù)測到pi3kca啟動子區(qū)可能存在HNF1、STAT和NF-k B轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;pi3kc2b啟動子區(qū)存在FOXO1、PPAR-RXR、STAT、IK1、HNF6和HNF3轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;pi3kc3啟動子區(qū)存在FOXO1和STAT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。為了進一步驗證黃顙魚pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3不同區(qū)域啟動子的功能。我們通過構(gòu)建pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3啟動子缺失序列表達載體,分別瞬時轉(zhuǎn)染到Hep G2細胞,通過雙熒光素酶活性測定,確定pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3啟動子的活性區(qū)域。結(jié)果顯示:pi3kca的-360/-224 bp區(qū)域負調(diào)控啟動子活性,而-224/+71 b區(qū)域正調(diào)控啟動子活性;pi3kc2b的-1848/-1522 bp區(qū)域正調(diào)控啟動子活性,-1522/-623 bp區(qū)域不影響啟動子活性,-623/-388 bp負調(diào)控啟動子活性,-388/-144 bp正調(diào)控啟動子活性,-144/+79 bp區(qū)域正調(diào)控啟動子活性;pi3kc3的-367/-291 bp區(qū)域不影響啟動子活性,而-291/+59 bp區(qū)域正調(diào)控啟動子活性。同時,我們還發(fā)現(xiàn)FOXO1抑制劑AS1842856孵育顯著降低pi3kc2b和pi3kc3部分載體的啟動子活性。進一步的定點突變分析和凝膠阻滯分析(electrophoretic mobility-shift assay,EMSA)證明HNF1和IK1轉(zhuǎn)錄因子分別能直接與pi3kca和pi3kc2b啟動子結(jié)合,并負調(diào)控pi3kca和pi3kc2b啟動子活性;而FOXO1轉(zhuǎn)錄因子能夠直接與pi3kc2b和pi3kc3啟動子結(jié)合,并正調(diào)控啟動子活性。3、黃顙魚不同組織pi3kca啟動子甲基化特征的初步研究為了分析黃顙魚不同組織中pi3kca的轉(zhuǎn)錄水平與其啟動子的甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系。我們應(yīng)用重亞硫酸鹽修飾黃顙魚不同組織的DNA,并通過BSP(bisulfite sequencing PCR)法測定黃顙魚不同組織pi3kca啟動子的甲基化水平,應(yīng)用熒光定量PCR的方法檢測黃顙魚不同組織中pi3kca以及甲基轉(zhuǎn)移酶(dnmts:dnmt1,dnmt3a,dnmt3b)的mRNA表達水平。結(jié)果共擴增得到pi3kca啟動子和第一外顯子Cp G島附近536 bp序列,包含34個Cp G位點。通過統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)pi3kca甲基化位點主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)附近的-71,-64,-52和+8 Cp G位點,并且pi3kca啟動子在黃顙魚不同組織中均處于低甲基化水平。定量PCR分析顯示,pi3kca在不同組織中的mRNA表達水平和甲基化水平無明顯相關(guān)性,而3種dnmts均在卵巢中表達量最高,這很可能與pi3kca啟動子甲基化水平也在卵巢中最高有關(guān)。4、胰島素激活I(lǐng)RS-PI3K-AKT信號通路調(diào)控黃顙魚肝臟脂代謝的機制研究為了研究胰島素對黃顙魚肝臟脂代謝的調(diào)控機制,本研究分別結(jié)合離體肝細胞實驗和活體原位注射實驗來進行。首先,通過分離原代黃顙魚肝細胞,選取(0、10n M、100 n M、1000 n M)四個濃度的胰島素進行孵育肝細胞,分別在48 h取樣,測定的指標包括肝細胞存活率、不同亞型IRS-PI3K-AKT基因的表達、肝細胞甘油三酯(TG)的累積、脂代謝相關(guān)酶酶活與基因表達。結(jié)果顯示:胰島素有促進肝細胞TG合成的趨勢,100 n M胰島素處理顯著增加肝細胞TG的合成。對于不同亞型的IRS-PI3K-AKT基因表達的影響,胰島素不同程度增加了肝細胞irs1、irs2、pi3kcb、pi3kc2a、akt1和akt2的mRNA表達水平,但不影響pi3kca、pi3kcd、pi3kcg、pi3kc2b、pi3kc3、akt3a和akt3b的mRNA表達水平。胰島素顯著促進肝細胞FAS、G6PD和6PGD酶活性的增加,但不影響CPT-I的活性。此外,胰島素促進fas、g6pd、6pgd和pparγ等脂代謝合成基因的表達,而降低cpt 1a和pparα等脂代謝分解基因的表達。本研究表明,在黃顙魚肝細胞中,對于不同亞型的IRS-PI3K-AKT蛋白,胰島素很可能優(yōu)先激活irs2、pi3kcb、pi3kc2a、akt1和akt2亞型。其次,胰島素能夠促進肝細胞TG的合成,但存在一定的濃度效應(yīng),其中100 n M胰島素處理組最為顯著。其次,為了進一步驗證胰島素是否能實際調(diào)控黃顙魚肝臟脂代謝,比較離體與在體條件下胰島素對黃顙魚脂代謝影響的差異。我們通過黃顙魚腹腔注射(0、0.01μg/g、0.1μg/g、1μg/g)四個胰島素濃度,分別在48 h取樣,分析黃顙魚肝臟脂肪的沉積、肝臟脂肪代謝相關(guān)酶酶活和基因表達水平的影響。結(jié)果顯示:隨著胰島素注射濃度增加,肝臟脂肪滴沉積增加,FAS酶活性也隨著增加。胰島素促進G6PD和6PGD酶活性的增加,但不影響CPT I的活性。對脂代謝基因表達的影響,胰島素有增加fas和g6pd基因表達的趨勢。0.01μg/g和0.1μg/g胰島素處理組顯著增加6pgd基因的表達。0.1μg/g胰島素注射顯著增加cpt 1a的表達。胰島注射降低pparα的表達。0.01μg/g和0.1μg/g胰島素處理組顯著增加pparγ的表達。本研究表明,無論是活體注射和離體實驗,胰島素促進黃顙魚肝臟脂肪滴的沉積,并且伴隨著FAS、6PGD、G6PD和PPARγ脂肪合成相關(guān)酶酶活增加和基因表達的上調(diào)。而胰島素對cpt 1a基因的表達的影響在離體和在體實驗中呈現(xiàn)不同的趨勢,表明胰島素對CPT I的調(diào)控可能受多種因素的影響。5、PI3K和FOXO1信號通路在胰島素調(diào)控黃顙魚脂代謝中的作用為了深入了解PI3K和FOXO1信號通路在胰島素影響黃顙魚脂代謝過程中的作用機制。我們探討了離體條件下,PI3K特異性抑制劑(Wortmannin)和FOXO1特異性抑制劑(AS1842856)的添加對胰島素誘導黃顙魚肝細胞脂代謝的調(diào)控變化。胰島素與Wortmannin共同孵育的結(jié)果顯示:與對照組相比,單獨的Wortmannin孵育降低肝細胞TG的沉積,但沒有影響fas、g6pd、6pgd、pparα和pparγ相關(guān)基因的表達,并且降低cpt 1a基因的表達。與胰島素處理組相比,Wortmannin提前孵育顯著降低胰島素誘導肝細胞TG的合成,并且顯著降低了胰島素誘導g6pd、6pgd和pparγ的表達,但不影響fas和cpt 1a的表達。本研究再次證明胰島素促進肝細胞脂肪合成的作用,而這一作用能夠被PI3K特異性抑制劑Wortmannin阻斷,表明PI3K信號通路在胰島素影響黃顙魚脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要作用。其次,AS1842856單獨孵育結(jié)果顯示:AS184285顯著降低所有PI3K亞型的基因表達,并且pi3kcb和pi3kc3對AS1842856的敏感度更強。胰島素與AS1842856共同孵育的結(jié)果顯示:與對照組相比,AS1842856單獨處理顯著降低TG的合成;與胰島素處理組相比,AS1842856處理顯著降低胰島素誘導TG的合成。與對照組相比,單獨AS1842856處理不影響fas和6pgd的基因表達水平,但降低g6pd、pparγ、pparα和cpt 1a的表達水平。與胰島素處理組相比,AS1842856提前孵育顯著下降胰島素誘導g6pd、6pgd和pparγ基因的表達。本研究表明,胰島素促進肝細胞脂肪合成作用同樣能夠被FOXO1抑制劑AS1842856阻斷,一方面說明FOXO1信號通路可能直接參與胰島素調(diào)控脂肪代謝的合成作用,另一方面說明FOXO1抑制劑AS1842856很可能是通過抑制PI3K的轉(zhuǎn)錄水平來抑制PI3K信號通路,從而導致胰島素利用PI3K信號通路促進肝細胞脂肪合成的作用再次被阻斷。本研究表明AS1842856很可能從FOXO1和PI3K雙重層面阻斷胰島素促進肝細胞脂肪合成作用。
【圖文】：

黃顙魚 PI3Ks 功能解析及其信號通路在胰島素調(diào)控肝臟脂代謝中的作用第一章 文獻綜述1 磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）的研究進展磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）能夠催化細胞膜上的磷脂酰肌醇（PI）產(chǎn)生細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第二信使 PIP3，進而募集和激活下游的靶物質(zhì)，并啟動一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，在細胞的增殖、凋亡、存活以及代謝等細胞生物學進程中發(fā)揮著重要的作用（Foster et al 2003）。

圖 1.2 胰島素信號通路對營養(yǎng)代謝調(diào)控示意圖（Boucher 2014)Fig 1.2 Regualtion of insulin signal pathway on nurtrient metabolism.2.1 胰島素胰島素（insulin, Ins）是由胰島 β 細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖乳糖核精氨酸和胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白激素，是糖代謝調(diào)節(jié)的重要參與者具有降低血糖的生理功效，其功能在人和部分哺乳類動物中已有很大進展。由于類天生對糖的利用率非常低，而胰島素又是調(diào)控糖代謝的重要激素，因而魚類的島素及其信號通路的功能也受到越來越多的關(guān)注。胰島素最先在機體內(nèi)是以前胰島素原（preproinsulin）形式存在，其基因序列前在 30 多種魚類中已有報道（Caruso and Sheridan 2011）。胰島素基因的結(jié)構(gòu)主要括 3 個外顯子和 2 個內(nèi)含子。大部分魚類如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）等存在種胰島素基因（Caruso and Sheridan 2011），而在大口黑鱸（Micropterus salmoides只存在一種（靳利娜 2011）。胰島素基因編碼的氨基酸個數(shù)大約 105~116 之間，
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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本文編號：2690186