【摘要】：陽離子非依賴6-磷酸甘露糖受體(cation-independent mannose-6-phosphate receptor,CI-MPR)又稱胰島素樣生長因子II受體(Insulin-like growth factor-II receptor,IGF2R),隸屬于P型凝結(jié)素家族,是一種多能細(xì)胞受體。然而,過去對CI-MPR的研究主要局限于脊椎動物,在甲殼動物中尚沒有相關(guān)的研究報道。擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是一種典型的甲殼動物,廣泛分布于我國的東南沿海等地。近年來,對擬穴青蟹的研究已取得了一定成果。擬穴青蟹良好的研究背景為研究CI-MPR基因的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究以擬穴青蟹CI-MPR(以下稱Sp CI-MPR)基因為研究對象,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.獲得擬穴青蟹CI-MPR基因的全長序列本研究在已知部分序列的基礎(chǔ)上,利用RACE方法獲得了擬穴青蟹Sp CI-MPR基因的c DNA全長序列,序列已上傳至Gen Bank(Accession number:KM658157)。該序列長度為3931 bp,編碼1095個氨基酸。序列分析顯示該基因編碼的蛋白含有7個保守的“MRH”結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域均含有保守的6-8個半胱氨酸,該結(jié)構(gòu)為CI-MPR蛋白的特異保守結(jié)構(gòu)域。對氨基酸序列進(jìn)行BLASTP在進(jìn)行同源性檢索發(fā)現(xiàn)Sp CI-MPR蛋白序列與其它動物的CI-MPR蛋白序列具有較高的同源性�；贑I-MPR蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹同物種進(jìn)化關(guān)系保持一致。由此表明已成功克隆到擬穴青蟹Sp CI-MPR基因的c DNA全長序列。2.生物信息學(xué)方法對Sp CI-MPR基因進(jìn)行功能和特征分析該蛋白存在大量的糖基化和磷酸化位點。在Sp CI-MPR蛋白的7個結(jié)構(gòu)域中,結(jié)構(gòu)域5和結(jié)構(gòu)域6同哺乳動物的結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域9擁有較高的同源性,推測兩個結(jié)構(gòu)域在磷酸甘露糖(mannose 6-phosphate,Man-6-P)結(jié)合時發(fā)揮著重要的作用。同時,基于結(jié)構(gòu)比對的分析發(fā)現(xiàn),Sp CI-MPR蛋白缺少與IGF-II結(jié)構(gòu)位點相關(guān)的疏水基團(tuán)和必須氨基酸,由此推測擬穴青蟹的Sp CI-MPR蛋白不具有調(diào)控IGF-II的功能。3.對Sp CI-MPR基因進(jìn)行時空表達(dá)分析為研究Sp CI-MPR基因?qū)M穴青蟹生長和早期發(fā)育的影響,本文檢測了其在擬穴青蟹從剛出生后的蚤狀幼體I期(Zoea I,Z1)、蚤狀幼體II期(Zoea II,Z2)、蚤狀幼體III期(Zoea III,Z3)、蚤狀幼體IV期(Zoea IV,Z4)、蚤狀幼體V期(Zoea V,Z5)和大眼幼體(Megalopae,M)Sp CI-MPR基因表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),從胚胎到幼體出生后3天內(nèi)其表達(dá)量無顯著變化,此后其表達(dá)量逐漸上升,在Z2達(dá)到最高,然后逐漸下降并趨于平穩(wěn)。同時,我們還檢測了該基因在擬穴青蟹肌肉、血液、肝胰腺、胃、腮、睪丸、卵巢、心臟鰓、結(jié)締組織、胸神經(jīng)節(jié)和腦神經(jīng)節(jié)這11個組織中的表達(dá)分布情況。結(jié)果顯示Sp CI-MPR基因的表達(dá)量呈現(xiàn)一定的組織特異性,在肝胰腺、血液和心臟這3個組織中的表達(dá)量最高,在其他組織中的表達(dá)量較低。上述結(jié)果暗示Sp CI-MPR基因可能在擬穴青蟹的生長發(fā)育起著重要的作用。4.擬穴青蟹中Sp CI-MPR基因的印跡表達(dá)模式以及與其表達(dá)量之間的關(guān)系對Sp CI-MPR基因的序列分析發(fā)現(xiàn)在5'端含有大量的Cp G島序列,為潛在的甲基化位點,提示該基因可能為印跡基因。對雜合子等位基因的轉(zhuǎn)錄情況分析表明Sp CI-MPR基因為印跡基因。組織水平的分析提示Sp CI-MPR基因在擬穴青蟹中印跡表達(dá)模式具有組織特異性。同時結(jié)果顯示Sp CI-MPR基因在正常非印跡組織中的表達(dá)量明顯高于印跡組織中的表達(dá)量,Sp CI-MPR基因的印跡狀態(tài)與其表達(dá)水平之間具有一定的相關(guān)性。印跡調(diào)控通過改變有效轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)來進(jìn)行調(diào)控表達(dá)對基因的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控,從而影響生長和發(fā)育等過程。5.載體構(gòu)建了原核表達(dá)載體,獲得重組蛋白此外,我們利用p ET-30a(+)載體構(gòu)建了原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株中表達(dá)得到了130.5 k Da的融合蛋白,同時我們優(yōu)化了重組融合蛋白表達(dá)的最佳條件。SDS-PAGE和Western-Blotting鑒定結(jié)果均表明已成功獲得了重組融合蛋白。重組蛋白的成功表達(dá)為今后深入研究Sp CI-MPR基因的功能提供了研究材料。
【圖文】：

2圖 1-1 印跡基因簇結(jié)構(gòu)組成元件 (Bartolomei, 2009)[18]Fig. 1-1 Components of an imprinted gene cluster

圖 1-2 印跡基因特征示意圖 (Reik, 2001)[24]因 1 為印跡基因，基因 2 為正常非印跡基因。Fig. 1-2 Characteristics of imprinted genese 1 is a imprinting gene while allele 2 is a normal gene.
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 路心平;馬凌波;喬振國;張鳳英;馬春艷;;利用線粒體DNA標(biāo)記分析中國東南沿海擬穴青蟹種群遺傳結(jié)構(gòu)[J];水產(chǎn)學(xué)報;2009年01期

2 黎中寶,李少菁,王桂忠;中國東南沿海鋸緣青蟹群體的形態(tài)判別分析[J];廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2004年01期

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本文編號：2690021